Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Marta M. Kilian

The Role of Macrophages

in Murine Intraocular Melanoma

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107339

title (ger.)

Rolle der Makrophagen beim intraokularen Melanom der Maus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kilianm_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Das uveale Melanom ist der häufigste intraokulare Tumor bei der erwachsenen kaukasischen Bevölkerung. Die Behandlung des primären okularen Tumors bietet vielversprechende Therapiemöglichkeiten, jedoch verschlechtert sich die Prognose des Patienten enorm, wenn Metastasen klinisch in Erscheinung treten. Mikrometastasen in der Leber können sich sehr früh etablieren, zugleich aber für mehrere Jahrzehnte “stumm” verbleiben. Das Augenmerk vieler Studien über das uveale Melanom richtet sich daher auf die Signalwege und die Prävention der hämatogenen Metastasierung. Zahlreiche Eigenschaften von Aderhautmelanomen konnten bislang statistisch mit der Prognose des Patienten korreliert werden. Hierzu gehören klinische (z.B. Alter des Patienten), histopathologische (z.B. Tumorgröße, Gefäßdichte, vasculogenic mimicry, tumor-assoziierte Makrophagen) und genetische Charakteristiken. In vivo Studien in Mäusen gestalten sich jedoch nach wie vor schwierig: Alle bisherigen Mausmodelle besitzen gewisse Einschränkungen, da spontane uveale Melanome in Wildtyp-Mäusen noch nicht beschrieben wurden und demnach als adäquates Modell nicht zur Verfügung stehen.

Neben zahlreichen anderen Arbeitsgruppen untersuchten auch wir eine neue transgene (Hgf-Cdk4) Mauslinie, welche spontan Hautmelanome entwickelt und deren Augen bisher noch nicht auf die Entstehung von spontan auftretenden uvealen Melanomen überprüft wurde. Abgesehen vom Zufallsbefund stark pigmentierter Zellen in der Cornea der Hgf-Cdk4 Mäuse, konnten wir keinerlei Hinweise auf melanozytäre Proliferationen in der Uvea finden (Kapitel VI). Dies unterstreicht nochmals die Unterschiede in der Pathogenese zwischen kutanen und uvealen Melanomen, die sich sowohl genetisch als auch durch ihr klinisches Verhalten unterscheiden. Neben Mausmodellen, bei denen humane Aderhautmelanomzellen in das Auge immunsupprimierter Mäuse injiziert werden, ist die intraokulare Injektion von murinen Hautmelanomzellen gut etabliert. Trotz gewisser genetischer Unterschiede zwischen Aderhaut- und Hautmelanomzellen, ermöglicht diese Methode Untersuchungen zur intraokularen Tumorbiologie in einem immunologisch funktionsfähigen Organismus. Wir modifizierten daher ein bisher etabliertes Mausmodell und injizierten HCmel12 Zellen (murine, kutane Melanomzellen) in den Glaskörperraum des Auges von CX3CR1+/GFP und flt-1/eGFP BAC Mäusen zweier Altersklassen, um insbesondere den Einfluss tumor-assoziierter Makrophagen auf das Tumormikromilieu unter Berücksichtigung des Lebensalters zu untersuchen. Intraokulare Tumore von HCmel12 Zellen zeichneten sich aus durch angiotropes Wachstum, Angiogenese, Vasculogenic Mimicry/ Mikrozirkulationsmuster und eine Immunzellinfiltration mit hohem Makrophagenanteil. Diese Eigenschaften sind allesamt für das humane Aderhautmelanom charakteristisch. Eine rein hämatogene Metastasierung konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Kapitel II).

Im Vergleich zu jungen Mäusen zeigten alte Mäuse in unseren Studien ein aggressiveres Wachstumsmuster (histologisch) sowie das vermehrte Auftreten von M2 Makrophagen (durchflusszytometrische Analyse) und wiesen somit eine größere Ähnlichkeit zu humanen uvealen Melanomen auf (Kapitel IV). Demzufolge bietet das von uns etablierte Tumormodell in alten Mäusen die Möglichkeit, das intraokulare Tumormikromilieu in dem semi-geschlossenem System des Auges (Blut- aber keine Lymphgefäße) zu untersuchen, welches iatrogen durch systemische oder intraokulare Injektionen manipuliert werden kann.

Um die allgemeine Rolle der Makrophagen beim intraokularen Melanom untersuchen zu können, wurden histologische Tumorwachstumseigenschaften von systemisch Makrophagen-depletierten Mäusen mit denen unbehandelter Tiere verglichen. Bei unbehandelten Mäusen war die Häufigkeit prognostisch signifikanter Mikrozirkulationsmuster (Kapitel IV) sowie der Anteil aktiver Angiogenese (Kapitel V) erhöht. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass tumor-assoziierte Makrophagen unterschiedliche Vaskularisationsstrategien des Tumors begünstigen und damit zur Tumorprogression beitragen können. Weiterhin untersuchten wir die Rolle von funktionell polarisierten Makrophagen, welche einen tumoriziden M1 Phänotyp oder einen Tumor-begünstigenden M2 Phänotyp annehmen können. Hierfür wurden HCmel12 Zellen in vitro in einem M1- oder M2-dominierten Mikromilieu inkubiert und anschließend ins Mausauge injiziert. Tumore aus M2-konditionierten Melanomzellen zeigten histologisch eine erhöhte Infiltration mit Makrophagen, ein verstärktes Auftreten von Kollagen 4-positiven Strukturen und eine höhere mittlere Gefäßdichte verglichen zu M1-konditionierte Tumoren. Demnach konnten wir zeigen, dass tumor-assoziierte Makrophagen - und hier insbesondere M2 Makrophagen – durch tumor-begünstigende Faktoren (wie stromale Umbaumechanismen im Sinne von Mikrozirkulationsmustern, Entzündungszellinfiltration und vermehrter Angiogenese) direkt zu einem aggressiveren Tumorphänotyp beitragen können (Kapitel IV). Zudem konnten wir in flt-1/eGFP BAC Mäusen feststellen, dass der Großteil der Tumorgefäße CD31+GFP+ war und demnach murinen Strukturen entstammte. Dies deutet auf “Co-option” von Wirtsgefäßen mit anschließender Angiogenese aus bereits existierenden Mausgefäßen als Hauptvaskularisationsstrategie des Tumors hin (Kapitel V). Allerdings zeigten sich auch vereinzelt CD31+GFP- Gefäße, welche folglich einer anderen Vaskularisierungsstrategie - Vaskulogenese oder aus Tumorzellendothelien - entstammt sein müssen. Laufende Untersuchungen mit Stammzell- und Melanommarkern sollen deren endgültigen Ursprung aufklären. Dies könnte dazu beitragen potentiell ein neues Modell zur Unterscheidung von Angiogenese und Vaskulogenese zu etablieren.

Zusammenfassend, ein “gealtertes” Immunsystem mit einem erhöhten Anteil an M2 Makrophagen bietet eine tumor-begünstigende Grundlage. Diese Erkenntnisse können potentielle Ansatzpunkte für zukünftige therapeutische Interventionen darstellen, da sie möglicherweise auf andere Tumoren übertragbar sind.

abstract (englisch)

Uveal melanoma is the most common intraocular tumour in the adult Caucasian population. While local treatment of the primary ocular tumour is very effective, prognosis worsens dramatically when metastatic disease appears. Hepatic micrometastases may establish early and remain dormant for decades. Understanding its pathways and preventing hematogeneous metastasis is a major goal uveal melanoma research. Several prognostic factors have been determined so far, including clinical (e.g. age), histopathologic, (e.g. tumour size, mean vascular density [MVD], vasculogenic mimicry/ extravascular matrix patterns, tumour associated macrophages [TAM]) and genetic characteristics. However, in vivo studies in mice remain challenging. All murine models are subject to restrictions as spontaneous uveal melanoma has not been described in wild type mice, yet. In search for spontaneous ocular melanomas, among other groups, we examined the eyes of transgenic mice which exhibit spontaneous skin melanoma. Apart from an incidental and unusual finding of heavily pigmented cells in the cornea, Hgf-Cdk4 mice did not show any melanocytic proliferations in the uvea (chapter VI). However, this underlines genetic and clinical differences between uveal and skin melanoma.

Besides mouse models in which human uveal melanoma cells are injected into the eye of immunodeficient mice, there are also other well established mouse models like intraocular inoculation with murine cutaneous melanoma cells. Despite genetic differences, such a model allows investigations on intraocular tumour biology in an immunocompetent animal. We modified such an established mouse model by injecting HCmel12 murine cutaneous melanoma cells into the ocular vitreous of CX3CR1+/GFP mice and flt-1/eGFP BAC mice of different age groups. We were particularly interested in the role of macrophages in intraocular melanoma of aged mice (10-12 months). Intraocular tumours of HCmel12 melanoma cells showed solid and aggressive growth with angiotropism, angiogenesis, vasculogenic mimicry/ extravascular matrix patterns, inflammatory cell infiltration with pronounced macrophage proportions, but no hematogenously dispersed metastases (chapter III). In our studies, old mice exhibited more aggressive tumours (histologically) and an increased number of M2 macrophages (flow cytometry analysis) compared to young mice. Thus, aged mice better resembled uveal melanomas growth characteristics. Hence, our intraocular tumour model in mice of advanced age offers the opportunity to study the tumour microenvironment in a semi-closed system (eye, blood but no lymphatic vessels), which can be manipulated iatrogenically by systemic or intraocular injections.

To investigate the general role of macrophages in intraocular melanoma we examined histologically tumour growth characteristics of systemically macrophage-depleted mice in comparison to untreated mice. The frequency of prognostically significant extravascular matrix patterns (chapter IV) and active angiogenesis (chapter V) was increased in untreated mice compared to macrophage-depleted mice. These results suggest that TAM promote different tumour vascularisation strategies in intraocular melanoma and thereby contribute to tumour progression. Further, we studied the role of polarised macrophages which can be functionally subdivided into a M1 phenotype with tumouricidal and a M2 phenotype with tumour-favouring properties. HCmel12 cells were incubated in vitro in a M1- or M2-dominated environment and then injected into the mouse eye. Tumours of M2-conditioned melanoma cells showed an increased TAM infiltration, more collagen IV stroma patterns and a higher MVD compared to M1-conditioned tumours. Thus, aggressive, pro-angiogenic and tumour promoting factors such as inflammatory cell infiltration, stroma remodelling and MVD could be directly attributed to the existence of TAM, in particular to M2 macrophages (chapter IV). In flt-1/eGFP BAC mice we further found that the majority of tumour vessels were CD31+GFP+ and thus of angiogenic host origin (chapter V). Hence, the main vascularisation strategy in our tumour model was co-option of host vasculature followed by induction of angiogenesis from existing host vessels. However, some vessels were observed to be CD31+GFP- and thus of vasculogenic or tumour-derived origin. Ongoing studies using stem cell and melanoma markers might reveal their final origin and offer potentially new animal models to distinguish between angiogenesis and vasculogenesis in tumours or other pathologies.

Taken together, an aged immunoprofile with an increased number of M2 macrophages provides a tumour-favouring microenvironment and might be a basis for tumour progression and metastasis. These findings could be a target for future therapeutic interventions in different tumour entities.

keywords

Tumor assoziierte Makrophage, Intraokulares Melanom, Vasculogenic Mimicry , Tumour associated macrophages, Intraocular Melanoma, Vasculogenic Mimicry

kb

9.868