Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Muhammad Akram Khan

Expansion of regulatory T cells in Theiler’s murine encephalomyelitis virusinfected

C57BL/6 mice

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106565

title (ger.)

Expansion von regulatorischen T-Zellen in Theilervirus-infizierten C57BL/6-Mäusen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/khanm_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Bei der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen handelt es sich um eine der häufigsten Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Die experimentelle Theilersche murine Enzephalomyelitis (TME) zeigt deutliche Parallelen zur chronisch-progressiven Form der MS und stellt daher ein anerkanntes Tiermodell zur Untersuchung von Entmarkungsprozessen dar. Nach einer akuten Infektionsphase im Gehirn wird das Virus in resistenten C57BL/6-Mäusen vollständig eliminiert, wohingegen eine unzureichende antivirale Immunantwort in empfänglichen SJL-Mäusen eine Viruspersistenz bedingt. Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die effiziente antivirale Immunität in resistenten Mäusestämmen. Weiterhin zeigen verschiedene Studien einen hemmenden Einfluss von regulatorischen T-Zellen (Treg) auf die TME Virus-spezifische Immunität bei empfänglichen Mäusen. Allerdings ist die Bedeutung von Treg in C57BL/6-Mäusen bei der TME bislang unklar. Ziel der Arbeit war daher den Effekt einer Expansion von Treg mittels Interleukin-2 Immunkomplexen und einer antikörpervermittelten Depletion von CD8+ T-Zellen in vivo auf den Verlauf der TME in C57BL/6-Mäusen näher zu untersuchen und Einblicke in die Interaktion von Treg mit anderen Leukozyten-Populationen bei chronischen neurologischen Krankheiten zu geben.

In der Studie konnte die zentrale Bedeutung von zytotoxischen T-Zellen für die antivirale Immunität bei der TME bestätigt werden. In Übereinstimmung mit vorherigen Berichten rief die einfache Manipulation von Treg nur marginale Effekte bei infizierten Tieren hervor. In Kombination mit einer CD8-Depletion konnten allerdings deutliche Effekte der Treg-Expansion auf die antivirale Immunität in TME Virus-infizierten C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden. Mittels Durchflusszytometrie konnte ein erhöhter Prozentsatz Foxp3+ Treg im Blut und in der Milz in Verbindung mit einer erhöhten CD4/CD8-Ratio in C57BL/6-Mäusen nach CD8-Depletion und Treg-Expansion nachgewiesen werden. Die anhaltende Treg-Expansion durch diese kombinierte Behandlung spricht außerdem für einen inhibitorischen Effekt von CD8+ T-Zellen auf Treg. Phänotypische Veränderungen in der Peripherie waren mit einer verstärkten Infiltration von Leukozyten in Gehirn und Rückenmark der Tiere vergesellschaftet. Mittels Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion konnte eine chronische Infektion in Gehirnen bis zum 42. Versuchstag in kombiniert behandelten Mäusen nachgewiesen werden. Immunhistologisch fand sich eine signifikant erhöhte Anzahl an CD3+ T-Zellen, CD45R+ B-Zellen und CD107b+ Makrophagen/Mikroglia am 14. Versuchstag. Foxp3+ Treg konnten hingegen bis zum Ende des Tierversuchs (42. Versuchstag) im Hippocampus von kombiniert behandelten Mäusen nachgewiesen werden. Im Rückenmark führt die CD8-Depletion sowie die kombinierte Behandlung zu einer reduzierten Viruselimination und anhaltenden Leukomyelitis. Mittels Immunhistologie fand sich ein signifikanter Verlust des Myelin-basischen Proteins am 42. Versuchstag in kombiniert behandelten Tieren. Außerdem konnte eine signifikante Zunahme von degenerierten Axonen mit akkumuliertem β-Amyloid-Vorläuferprotein in Entmarkungsherden der spinalen weißen Substanz nachgewiesen werden. Als Ausdruck einer potentiellen Typ IV-Hypersensitivität konnte eine dominierende Ansammlung von CD3+ T-Zellen und CD107b+ Makrophagen/Mikroglia im Rückenmark während der chronischen Phase festgestellt werden. Darüber hinaus fanden sich Infiltrate von Foxp3+ Treg und CD45R+ B-Zellen in spinalen Herden von C57BL/6-Mäusen nach kombinierter Behandlung.

Die Untersuchungen verdeutlichen das Vorhandensein von synergistischen Effekten einer Treg-Expansion und CD8-Depletion, die zu einer effizienten Reduktion der antiviralen Immunität in TME Virus-infizierten C57BL/6-Mäusen führen. Vergleichbar mit empfänglichen SJL-Mäusen konnte durch das Behandlungsschema eine chronische Infektion und Leukomyelitis mit Myelinverlust hervorgerufen werden. Zusätzlich zu einer Hemmung von zytotoxischen T-Zellen durch Treg muss aufgrund der Studienergebnisse außerdem ein regulatorischer Effekt von CD8+ T-Zellen auf Treg bzw. eine bidirektionale Interaktion beider Zellpopulationen bei infektiösen ZNS-Krankheiten angenommen werden. C57BL/6-Mäuse werden in der Forschung häufig für genetische Modifikationen verwendet. Die kombinierte Behandlung ermöglicht daher die Untersuchung von virusinduzierten immunpathologischen Prozessen bei der TME in transgenen Mäusen mit genetischem C57BL/6-Hintergrund in Folgeprojekten.

abstract (englisch)

Multiple sclerosis (MS), one of the most frequent central nervous system (CNS) diseases in young adults, is a chronic demyelinating disease of unknown etiology and possibly multifactorial causes. Due to clinical and pathological similarities, Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) represents a commonly used infectious animal model for the chronic-progressive form of human MS. Inadequate viral clearance in susceptible SJL mice leads to persistent infection of the CNS and immune mediated spinal cord demyelination. In contrast resistant C57BL/6 mice eliminate the virus from the CNS by specific cellular immunity, including effective CD8-mediated cytotoxicity. Previous studies have demonstrated that regulatory T cells (Treg) reduce antiviral immune responses in TME in susceptible mice strains. However, the function of Treg in resistant C57BL/6 mice remains undetermined. Thus the aim of the present study was to investigate the impact of in vivo-expansion of Treg by interleukin-2 immune complexes (Treg-expansion) and antibody-mediated CD8+ T cell depletion (CD8-depletion) upon TME virus-induced disease progression in C57BL/6 mice to get further insights into role of Treg and their interaction with other leukocyte subsets in persistent viral infections.

Results of the present study confirmed the central role of antiviral cytotoxicity for TME virus elimination in resistant C57BL/6 mice. In agreement with previous reports simple manipulation of the Treg-compartment showed only minor effect upon the disease course in resistant mice, though Treg-expansion exerted profound inhibitory responses in an CD8-reduced environment. Flow cytometric analyses revealed an increased percentage of Foxp3+ Treg in the blood and spleen of C57BL/6 mice following Treg-expansion and CD8-depletion (combined treated animals) associated with an increased CD4/CD8 ratio. Furthermore, a prolonged effect of Treg-expansion was observed in combined treated mice, indicative of an inhibitory effect of CD8+ T cells upon Treg. Peripheral phenotypical changes were associated with an enhanced recruitment of lymphocytes to the brain and spinal cord of TME virus-infected C57BL/6 mice as determined by histology. Real time polymerase chain reaction confirmed chronic brain infection at 42 days post infection (dpi) in combined treated C57BL/6 mice. Immunohistochemistry revealed a predominent infection of hippocampal neurons and significant infiltrations of CD3+ T cells, CD45R+ B cells and CD107b+ microglia/macrophages till 14 dpi in the cerebrum. Foxp3+ Treg were found in the hippocampus also during the late phase (42 dpi), potentially attributed to termination of inflammatory responses. In the spinal cord CD8-depletion and combined treatment led to prolonged infection and leukomyelitis in mice. Immunohistochemistry revealed a significant loss of myelin basic protein expression at 42 dpi in combined treated mice. Moreover, spinal cord demyelination was associated with an increase of β-amyloid precursor protein-postitive axons predominetely in combined treated mice, indicative of axonal damage. Inflammatory responses in the spinal cord white matter were dominated by CD3+ T cells and CD107b+ macrophages/microglia, suggestive of T cell-mediated immunopathology. In addition, significant numbers of Foxp3+ Treg and CD45R+ B cells were found in the spinal cord white matter during the late phase in combined treated C57BL/6 mice.

In conclusion, the present project demonstrates synergistic effects of combined Treg-expansion and CD8-depletion to efficiently reduce antiviral immune responses in TME virus-infected C57BL/6 mice, which renders them susceptible to develop chronic infection, leukomyelitis and myelin loss. In addtion to the well described inhibitory effect of Treg upon CD8+ T cells, also regulatory effects of cytotoxic cells upon Treg or bidirectional interaction of these two T cell subsets, respectively, may occur in infectious CNS disoders. C57BL/6 mice are widely used for genetic modification and several transgenic mice with this genetic background have been established for the use as animal models. Thus, findings will potentially support the development of novel therapeutic strategies for chronic inflammatory disorders and provide a base for future studies upon virus-induced immunopathology using transgenic mice.

keywords

Theilersche murine Enzephalomyelitis, Multiplen Sklerose, regulatorischen T-Zellen, Theiler’s murine encephalomyelitis, Multiple sclerosis, regulatory T cells

kb

4.287