Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Kristel Kegler Pangrazio

"In vitro and in vivo characterization of p75NTR-expressing glia and

investigations upon their origin in the canine central nervous system”

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106539

title (ger.)

In vitro- und in vivo-Charakterisierung einer p75NTR-exprimierenden Gliazellpopulation sowie Untersuchungen über ihre Herkunft im kaninen zentralen Nervensystem

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/keglerpangraziok_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Die Transplantation von p75-Neurotrophin-Rezeptor (NTR)-exprimierenden glialen Zellen, zu welchen Schwann-Zellen des peripheren Nervensystems (PNS), olfaktorische Hüllzellen (olfactory ensheathing cells; OECs) und Schwann-Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) gehören, repräsentiert eine vielversprechende therapeutische Strategie bei demyelinisierenden Erkrankungen des ZNS. Überdies zeigen alle drei Zelllinien neben ihrer nahezu identischen Morphologie und ihrem antigenetischen Phänotyp, ähnliche, aber nicht identische regenerative und remyelinisierende Fähigkeiten. Folglich ist für die Auswahl des für eine Transplantation am besten geeigneten Zelltypen eine vergleichende in vitro-Charakterisierung auf molekularer bzw. funktionaler Ebene sowie eine Untersuchungen zur Erforschung des Verhaltens dieser Zellen in situ im erkrankten ZNS stattfinden.

Ziele der vorliegenden Studie stellten somit i) die Charakterisierung der funktionalen Eigenschaften bezogen auf Kalium (K+)-Kanäle in kaninen Schwann-Zellen, gewonnen aus gesundem ZNS und PNS, mittels Patch Clamp-Technik und Microarray-Analysen, ii) die Untersuchung des Verwandtschaftsgrades zwischen beiden Schwann-Zell-Populationen und OECs sowie die Ermittlung möglicher Biomarker zur Unterscheidung dieser im Rahmen einer Transkriptom-Analyse und iii) Untersuchungen zur Herkunft von kaninen p75NTR-positiven Zellen, ihres Phänotyps und die Identifikation möglicher Zusammenhänge bei spontaner Schwann-Zell-Remyelinisierung bei einer natürlich auftretenden, entzündlichen ZNS-Erkrankung des Hundes dar.

In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass sich K+-Kanäle signifikant bei PNS- und ZNS-Schwann-Zellen unterscheiden. Während Schwann-Zellen aus dem ZNS prominente auswärts verzögerte rektifizierende Kaliumströme (outward delayed rectifier currents; KD) zeigten, wiesen Schwann-Zellen aus dem PNS neben KD- auch schnelle Kaliumströme vom KA-Typ auf. Diese funktionellen Unterschiede spiegelten sich allerdings nicht auf der mRNS-Ebene als unterschiedliche Expressionsmuster von spannungsabhängigen KV-Kanälen und akzessorischen β-Untereinheiten wider. Die O4-/A2B5-Expression war jedoch signifikant höher und die saure Gliafaserprotein (GFAP)-Expression signifikant niedriger bei Schwann-Zellen aus dem ZNS verglichen mit Schwann-Zellen aus dem PNS. Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass Schwann-Zellen aus dem ZNS sich in ihren in vitro-Eigenschaften von ihrem peripheren Pendant unterscheiden.

Sowohl das Muster der Kaliumströme als auch eine ausgeprägte O4-/A2B5-Expression erinnerten hierbei an Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (oligodendrocyte precursor cells; OPs). Folglich kann vermutet werden, dass Schwann-Zellen aus dem ZNS einige Eigenschaften von OPs während ihrer Entwicklung übernehmen.

Auf Transkriptom-Ebene deuteten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass es sich bei Schwann-Zellen aus dem ZNS und OECs grundsätzlich um die gleichen Zelltypen mit einer variablen Differenzierung, wahrscheinlich basierend auf ihren unterschiedlichen anatomischen Lokalisationen in vivo, handelt. Weiterhin zeigten die Microarray-Analysen, dass Schwann-Zellen aus dem PNS mit den oben genannten Zelltypen einen hohen Verwandtschaftsgrad mit einem geringgradig unterschiedlichen Transkriptom aufweisen. Zelltyp-spezifische Biomarker waren hierbei Aquaporin-1 als bester diskriminierender Marker für Schwann-Zellen des PNS und stimulator of chondrogenesis 1 als bester diskriminierender Marker für OECs und Schwann-Zellen des ZNS. Diese Ergebnisse wurden weiterhin durch immunhistologische und immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen untermauert. Diese Resultate können im Hinblick auf eine weitere Differenzierung der Zelltypen in zukünftigen Experimenten hilfreich sein.

Weiterhin wurde eine in situ-Untersuchung über die p75NTR-Expression in Schwann-Zellen bei einer spontan auftretenden, nicht-eitrigen, idiopathischen, entzündlichen ZNS-Erkrankung des Hundes durchgeführt. Bei dieser Erkrankung waren ein Auftreten von p75NTR/Sox2-doppelt positiven sowie eine durch Periaxin-Positivität charakterisierte Schwann-Zell-Remyelinisierung erkennbar. Die p75NTR-/Sox2-positiven Zellen ähnelten vom Phänotyp her entdifferenzierten Schwann-Zellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass diese Zellen wahrscheinlich eher aus dem PNS in das Gehirn einwanderten als sich aus OPs entwickelten.

Das Auftreten von entdifferenzierten Schwann-Zellen war unabhängig vom Vorhandensein von Astrozyten nachweisbar. Zudem schien ein von Makrophagen dominiertes, entzündliches Mikromilieu förderlich für ein Einwandern von Schwann-Zellen in die Läsion zu sein. Hierbei ähnelten die Ergebnisse im ZNS in bestimmten Aspekten den Prozessen nach einer Verletzung von peripheren Nerven. Weiterhin ist anzunehmen, dass die Entdifferenzierung, Migration und (Re-) Differenzierung von Schwann-Zellen Stadien einer Regeneration im ZNS darstellen.

Bei der Betrachtung des regenerativen Potentials von Schwann-Zellen stellen p75NTR-/Sox2-positive Zellen und mögliche Strategien zur Beeinflussung der Differenzierung dieser Zellen in remyelinisierende Zellen vermutlich aussichtsreiche therapeutische Ansätze bei der Behandlung von entzündlichen bzw. demyelinisierenden ZNS-Erkrankungen dar.

abstract (englisch)

Transplantation of p75 neurotrophin receptor (NTR) expressing glial cells including peripheral nervous system (PNS) Schwann cells, olfactory ensheathing cells (OECs) and central nervous system (CNS) Schwann cells represents a promising treatment strategy for demyelinating diseases of the CNS. Besides their identical morphology and antigenic phenotype, all three cell types possess similar but not identical regenerative and remyelinating capabilities. Thus, choosing the most suitable cell type for transplantation therapies requires a comprehensive in vitro characterization at the functional and molecular level as well as the understanding of their in situ generation, behavior and integration within the injured CNS microenvironment. Therefore, the aims of this thesis were i) to characterize the functional properties of potassium (K+) channels in canine CNS and PNS Schwann cells isolated from the healthy brain and peripheral nerve, respectively, using in vitro patch-clamping techniques and microarray analyses; ii) to evaluate the relatedness of both Schwann cells types with OECs and identify possible distinguishing biomarkers employing a transcriptome-based approach; and iii) to investigate the in situ origin of canine p75NTR expressing cells, their phenotype and their relation to spontaneous Schwann cell remyelination in a naturally occurring inflammatory CNS disease entity of dogs.

The present study revealed that K+ channels differed significantly in PNS and CNS Schwann cells, respectively. While CNS Schwann cells displayed prominent outward delayed rectifier currents (KD), PNS Schwann cells elicited KD- and KA-type K+ currents. These functional differences were not paralleled by differential mRNA expression of voltage-dependent (Kv) channels and accessory β-subunits. However, O4/A2B5 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression levels were significantly higher and lower in CNS than in PNS Schwann cells, respectively. Taken together, these data provide first evidence that CNS Schwann cells display specific in vitro properties, which are not shared by their peripheral counterpart. Both Kv currents and increased O4/A2B5 expression were reminiscent of oligodendrocyte precursor cells (OPs), suggesting that CNS Schwann cells retain features of OPs during maturation.

On the transcriptome level, the present findings indicated that CNS Schwann cells and OECs are basically the same cell type with variable differentiation based on their divergent anatomic localization in vivo. Furthermore, microarray analyses revealed that PNS Schwann cells are a highly related cell type with a slightly different transcriptome. Type-specific biomarkers employing class prediction experiments revealed aquaporin-1 as the best discriminative biomarker for PNS Schwann cells, and stimulator of chondrogenesis 1 as the most distinguishing one for OECs/CNS Schwann cells, which was further confirmed by immunocytochemistry. These results may be helpful for future experiments since there is increasing awareness of the unreliability of single markers to differentiate one cell type from another.

Finally, the in situ investigation of p75NTR expressing Schwann cells in a spontaneously occurring, non-suppurative, idiopathic inflammatory CNS condition of dogs revealed that this disease is accompanied by the occurrence of p75NTR/Sox2 double-positive cells and periaxin-positive remyelinating Schwann cells. The p75NTR/Sox2 expressing cells phenotypically resemble dedifferentiated Schwann cells. Furthermore, it can be hypothesized that p75NTR/Sox2-expressing Schwann cells most likely invaded the CNS from PNS sources rather than differentiating from OPs in the CNS. Additionally, the emergence of dedifferentiated Schwann cells was not impaired in the presence of astrocytes, and a macrophage-dominated inflammatory microenvironment might provide an adequate environment for the plasticity of Schwann cells within the CNS. Thus, the in situ results suggested that Schwann cell differentiation in a spontaneous CNS inflammatory condition resembles in several aspects their plasticity after peripheral nerve injury. In addition, it seemed that dedifferentiation, migration and (re)differentiation of Schwann cells in or into CNS lesion sites represents a natural regenerative mechanism in the CNS.

Considering the potential regenerative properties of Schwann cells, the targeting of p75NTR/Sox2 expressing cells and the development of strategies designed to enhance their differentiation into competent remyelinating cells appears to be a promising therapeutic approach to achieve regeneration in inflammatory/demyelinating CNS diseases.

keywords

p75NTR, Schwan cells, CNS / p75NTR, Schwan Zellen, zentralen Nervensystem  

kb

2.481