Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sabine Kastens

Pharmakologische Charakterisierung

von Ca2+- und motilitätsregulierenden Strukturen bei Eberspermien

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110612

title (eng.)

Pharmacological characterization of calcium- and motility regulating structures in boar spermatozoa

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kastenss_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Eine fein regulierte Calciumhomöostase ist essentiell für die Funktion und Fertilität von Spermien. Die Freisetzung von Calcium (Ca2+) aus internen Speichern ist über bestimmte Ionenkanäle rezeptorgesteuert. Das Ziel der Studie war zu untersuchen, inwiefern Inositol-triphosphat-Rezeptoren (IP3R) und Ryanodin-Rezeptoren (RyR) an der Regulation der intrazellulären (intraz.) Ca2+-Konzentration und der Motilität bei Eberspermien beteiligt sind. Zur Modulation wurden Thapsigargin (1,25 µM) als Inhibitor der sarco-/endoplasmatischen Retikulum Calcium-ATPase, Thimerosal (100 µM) als Stimulator der IP3R und RyR, Ruthenium Red (RR; 5 µM) als Inhibitor der RyR und 2-Aminoethoxydiphenyl Borat (2-APB; 10 µM) als Inhibitor der IP3R verwendet.

Es wurde in zwei experimentellen Abschnitten die Wirkung der Modulatoren auf (1) den intrazellulären Ca2+-Gehalt durchflusszytometrisch und (2) auf die kinematischen Parameter hinsichtlich eines möglichen Hyperaktivitätsmusters mit Hilfe der computerassistierten Spermienanalyse untersucht. Es wurden je Versuch mindestens drei normosperme Ejakulate von insgesamt 15 Ebern verwendet und in Beltsville Thawing Solution (BTS) verdünnt. Nach einer Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation (35 % / 70 %) zur Aufreinigung der Spermiensuspension, wurden die Ejakulate in Ca2+-haltigen (2 mM Ca2+) oder -freien (2 mM EGTA) HBS-basierten Medien mit und ohne Zusatz von Bicarbonat (Bic.) verdünnt und bei 38 °C inkubiert.

In Teil 1 wurden die Spermien mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM und mit Propidium Iodid (PI) als Indikator der Membranintegrität, beladen und für 5 min. inkubiert. Im Anschluss wurde Thimerosal oder Thapsigargin hinzugegeben. Veränderungen in den Fluo-4 Fluoreszenzintensitäten (FI) wurden durchflusszytometrisch in einer kontinuierlichen Messung über 6 min. bei plasmamembranintakten Spermien detektiert. Nach Zugabe von Thimerosal kam es zu einem Anstieg des intrazellulären Ca2+-Gehaltes innerhalb der ersten 80 sec. unabhängig vom Ca2+-Gehalt im Medium, der sich in einem zwei- bis dreifachen Anstieg der Fluo-4 FI widerspiegelte. Nach Zugabe von Thapsigargin wurde eine erhöhte intrazelluläre Ca2+-Konzentration in den Ca2+-freien Medien gemessen. Die Vorinkubation der Spermien mit RR verzögerte bei Vorhandensein von extrazellulärem Ca2+ den Thimerosal-induzierten Ca2+-Anstieg für 110 sec., wohingegen die Vorinkubation mit 2-APB nur zu einer leichten Verzögerung für 20 sec. führte. Eine gleichzeitige Vorinkubation mit RR + 2-APB verzögerte den Ca2+-Anstieg für 190 sec.

In Teil 2 wurden die Spermien in Ca2+-haltigen und -freien Medien mit und ohne Zusatz von Bic. (15 mM, 5 % CO2) inkubiert. Es fand eine Messung unmittelbar nach Zugabe und nach 5 min. Inkubation statt. Thapsigargin hatte keinen Einfluss auf die kinematischen Parameter. Thimerosal führte zu einer raschen Immobilisierung der Spermien, die in einem rigorähnlichen Zustand mündete. Ursächlich könnte ein schneller Anstieg der intraz. Ca2+-Konzentration unmittelbar nach Zugabe sein. 2-APB zeigte ausschließlich in den Medien ohne Bic. einen suppressiven Effekt auf die Motilität. In den Medien mit Bic. wurden Hinweise auf ein Hyperaktivitätsmuster gefunden. RR zeigte keinen Einfluss auf die kinematischen Parameter. Als nächstes wurden Spermien mit 2-APB, RR und 2-APB + RR für 15 min. vorinkubiert, bevor Thimerosal hinzugegeben wurde. Die Immobilisierung durch Thimerosal konnte weder durch 2-APB noch durch RR verzögert werden.

Schlussfolgernd haben Eberspermien einen Thimerosal- und Thapsigargin-sensitiven Ca2+-Signalweg. Beim Thimerosal-Signalweg scheinen vor allem die RyR eine regulatorische Funktion zu haben. Die IP3R scheinen synergetisch mit RyR beteiligt zu sein. Die Notwendigkeit von extrazellulärem Ca2+ für die Modulatorwirkung weist auf eine Beteiligung plasmamembranständiger Kanäle hin. Um die Beteiligung von RyR und IP3R zu bestätigen, wäre in zukünftigen Studien eine Lokalisierung mittels immunhistochemischen Verfahren zielführend. Die Beteiligung der RyR und IP3R an Motilitätsänderungen bei Eberspermien konnte nicht geklärt werden. Der Thapsigargin-Signalweg scheint sich ausschließlich auf intraz. Signalkaskaden zu beschränken, die in zukünftigen Studien über weiterführende Modulatorstudien charakterisiert werden sollten.

abstract (englisch)

Tight regulation of intracellular calcium homoeostasis is essential for sperm function and fertility. Release of Ca2+ from intracellular stores through ion channels is receptor-mediated. The aim of this study was to examine whether 1, 4, 5-trisphosphate receptors (IP3R) and ryanodin receptors (RyR) are involved in the regulation of intracellular Ca2+ concentration and motility in boar spermatozoa. For receptor modulations, Thapsigargin (1.25 µM) as inhibitor of the sarco-/endoplasmatic reticulum calcium ATPase (SERCA), Thimerosal (100 µM) as stimulator of the IP3R and RyR, Ruthenium Red (RR; 5 µM) as inhibitor of the RyR, and 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB; 10 µM) as inhibitor of the IP3R were used.

In two experimental series the effect of the modulators (1) on the intracellular calcium level was measured by flow cytometry, and (2) on kinematic parameters related to a possible hyperactivity pattern were measured by computer-assisted sperm analyses (CASA). In each experiment as many as three normospermic ejaculates from 15 different boars were diluted in modified Beltsville Thawing Solution (BTS). After Percoll®-density gradient centrifugation (35 % / 70 %) the ejaculates were diluted in calcium-rich (2 mM Ca2+) or calcium-free (2 mM EGTA) HBS-based media with and without Bicarbonat (Bic.) and were incubated at 38 °C.

In Part 1, the sperm were loaded with the calcium sensitive fluorescence dye Fluo-4 AM and with propidium iodid (PI) as indicator for membrane integrity and were incubated for 5 min. Subsequently Thapsigargin or Thimerosal were added. Changes in the Fluo-4 fluorescence intensity (FI) were detected in plasma membrane intact sperm with continuous flow cytometric measurements over 6 min.

After addition of Thimerosal a rise in the intracellular calcium concentration was detected within 80 sec. irrespective of the extracellular Ca2+-concentration which was reflected by a two-three-fold increase in Fluo-4 FI. After addition of Thapsigargin, an increased intracellular Ca2+ concentration was measured in calcium-free medium only. Next, spermatozoa were pre-incubated with IP3R-inhibitor 2-APB or the RyR-inhibitor RR for 15 min. before Thimerosal was added. Only in presence of external calcium, RR delayed the Thimerosal-induced rise in the intracellular Ca2+ concentration by 110 sec., whereas 2-APB only showed a slightly delayed effect by 20 sec. Simultaneous pre-incubation with RR and 2-APB delayed the Thimerosal-induced increase for 190 sec.

In Part 2, sperm were incubated in absence and presence of calcium with and without Bic. (15 mM, 5 % CO2). Measurement started directly after adding, and after further 5 min. of incubation. Thapsigargin had no effect on the kinematic parameters. Thimerosal leads to a fast immobilization of sperm which lead to rigor-like conditions induced by rapid increase in intracellular calcium concentrations. 2-APB showed a suppressive effect on motility only in media without previous in vitro capacitating treatment. With previous in vitro capacitating treatment, an indicator for hyperactivity pattern were found. RR had no influence on kinematic parameters. In the next step sperm were pre-incubated with 2-APB, RR and 2-APB + RR before Thimerosal was added. The immobilization through Thimerosal was not delayed through 2-APB or RR.

In conclusion, boar spermatozoa have a Thimerosal- and Thapsigargin-sensitive calcium pathway. In the Thimerosal-pathway, RyR-gated calcium channels seem to have a major regulatory function on intracellular calcium stores. IP3R seem to act synergistically with RyR-gated channels. The need of extracellular calcium for the modulator effects indicates the involvement of channels in the plasma membrane. Further studies should aim to localize RyR and IP3R on boar spermatozoa by immunochemistry techniques. Finally, indications for an involvement of RyR and IP3R gated channels in the regulation of boar sperm motility were found.

The Thapsigargin-pathway seems to be restricted to intracellular pathways which should be examined in further studies with modulators.

keywords

Calcium, IP3-Rezepor, Ryanodin-Rezeptor, calcium, IP3 receptor, ryanodin receptor

kb

3.409