Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ieva Kalve

“The co-layer method as an efficient way for neurotrophic factor release by transplanted genetically modified neuronal progenitor cells in a rat model of Parkinson’s disease – Analysis of morphological and functional integration

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104025

title (ger.)

„Die Colayer-Methode als eine effiziente Strategie zur Produktion neurotropher Faktoren durch genetisch veränderte neuronale Vorläuferzellen im Parkinsonmodell der Ratte’’

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kalvei_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Die Parkinson’sche Erkrankung ist eine neurodegenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems. Der Verlust der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta ist die Hauptursache für die motorischen Kardinalsymptome. Die intrastriatale Zelltransplantation bietet in diesem Zusammenhang einen relevanten therapeutischen Ansatz, jedoch stellt das schlechte überleben der transplantierten Zellen weiterhin ein ungelöstes Problem dar. Dahingehend nehmen wir an, dass das langfristige Überleben und Funktion der transplantierten Zellen verbessert wird, wenn die Transplantate mit adequatem neurotrophen Faktoren versorgt werden. Dafür wurde diese Studie in einem Rattenmodel der Parkinsonschen Erkrankung durchgeführt, wobei die neuronalen Progenitorzellen aus dem ventralen Mesencephalon mittels Nukleofektion transient gentisch modifiziert wurden, um für dopaminegre Neurone spezifische Überlebensfaktoren zu überexpremieren. Die Detektion der dopaminergen Zellen wurde mittels eines immunzytochemischen Nachweises der Tyrosinhydroxylase (TH) durchgeführt.

 Die Prozedur der Nukleofektion selbst sowie die ablösung des Zellrasens erniedrigte die Anzahl der TH-positiven Zellen im vergleich zu nicht transfizierten Schwesterkulturen. Daher wurden die abgelösten und transfizierten Zellen auf die adhärenten, nicht transfizierten Schwesterkulturen in einem Verhältnis 1:3 aufgesät. Dieses optimierte Zellkulturprotokoll wurde Colayer-Methode genannt, während das zuvor in unserem Labor eingesetzte Protokoll, in dem die abgelösten, transfizierten Zellen in leere Wells eingesät wurden, die Monolayer-Methode genannt wurde.

Der Vergleich der beiden Protokolle ergab zwei Wochen nach der Transplantation eine signifikant stark erniedrigte Anzahl der TH-positiven Zellen in der Monolyaer-Gruppe (271 ± 62) im Vergleich zu der Co-Layer-Gruppe (1723 ± 199). Aufgrund der viel versprechenden in vitro Daten der Kollegen in unserem Labor, wurden die brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-transfizierten Zellen in folgenden in vivo Experimenten transplantiert. Keine signifikaten numerischen oder funktionalen Unterscheide wurden zwischen den Kontroll- und BDNF-transfizierten Transplantaten festgestellt.

Insgesamt gesehen, hat jedoch die Colayer-Methode gezeigt, dass sie einen effizienten Weg zur Versorgung der transplantierten neuronalen Vorläuferzellen mit neurotrophen Faktoren darstellt. Daher, wird diese Methode weiterhin in vitro und in vivo eingesetzt, um die Wirkung anderer relevanter Faktoren zu testen, auch im Zusammenhang mit einer elaborierten Plattform für komplexere Verhaltensanalysen.

abstract (englisch)

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder of the central nervous system. The cardinal motor symptoms result from the loss of dopaminergic (DA) neurons in the midbrain. Exogenous cell replacement represents a potent treatment option for this disease state, still the DA survival rate after transplantation is low. According to our hypothesis the numerical and subsequent functional outcome would improve in case the implanted cells received an adequate neurotrophic support. This study was performed in a rat model of PD and the ventral mesencephalic neuronal progenitor cells (NPCs) were transiently genetically modified via nucleofection in order to provoke an overexpression of certain DA survival factors. DA cells were detected via immunohistochemical staining against the tyrosine hydroxylase (TH).

Nucleofection itself and cell detachment evolved in this procedure decreases the number of TH immunoreactive (THir) neurons compared to non-transfected sister cultures. Therefore, the detached and transfected cells were seeded on top of the adherent non-transfected sister culture in a ratio 1:3. These optimized cell culture conditions were named the co-layer method. The previously in our lab used protocol where the detached and transfected NPCs were seeded on empty wells was called the mono-layer method. Comparison of both cell culture procedures two weeks after grafting revealed a strongly reduced THir neuron number in the mono-layer group (271 ± 62) compared to the co-layer group (1723 ± 199). Based on the promising in vitro data obtained by other doctoral colleagues in our lab, brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-transfected cultures were implanted in the following in vivo experiments.  However no numerical or functional differences were observed between the BDNF-transfected and non-transfected co-layers as controls.

Nevertheless, the co-layer protocol proved to be an efficient way for transient delivery of cell-based neurotrophic factors released by transplanted progenitor cells. Thus this cell culture set-up will be used to study the numerical and functional DA effects in vitro and in vivo by further factors of interest, with respect to elaborated platform of more complex behavioral analyses.

keywords

Parkinsonmodell, Zelltransolantation, Neurotroph, parkinsonian, transplantation, neurotrophic

kb

4.384