Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Annette Julia Kaiser

 

 Interaktion primärer intestinaler Epithelzellen des Huhns mit niedrigpathogenem

aviären Influenzavirus und velogenem viszerotropen Newcastle disease Virus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109193

title (eng.)

Interaktion primärer intestinaler Epithelzellen des Huhns mit niedrigpathogenem aviären Influenzavirus und velogenem viszerotropen Newcastle disease Virus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kaisera_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Sowohl aviäre Influenzaviren (AIV) als auch Newcastle disease Viren (NDV) sind weltweit eine große Bedrohung für die Geflügelindustrie. Beide können eine schwere klinische Erkrankung, assoziiert mit einer hohen Mortalitätsrate, hervorrufen. Respiratorische Epithelzellen erwiesen sich als primäre Zielzellen für die Infektion und Replikation beider Viren. Die meisten AIV- und NDV-in vitro Studien haben sich auf Organkulturen des Respirationstraktes fokussiert, während Informationen bezüglich einer Virus-Wirt-Interaktion mit intestinalen Epithelzellen weitestgehend fehlen, obwohl Hinweise für einen Tropismus beider Viren für intestinale Epithelzellen (IECs) vorliegen. Bis heute sind nur wenige Studien zur Etablierung primärer Hühner-IECs vorhanden. Zudem sind diese Protokolle sehr unterschiedlich und wiederholbare Ergebnisse schwierig zu erlangen.

Aus diesem Grund war das erste Ziel der Studie, ein geeignetes, primäres Hühner-IEC-Modell zu etablieren. Mittels eines IEC-Scoring Systems verglichen wir einige publizierte IEC-Isolationsprotokolle, den Einfluss des Alters der Tiere, des Genotyps, der Inkubationstemperatur und der Zusammensetzung des Kulturmediums auf die Adhäsion und Proliferation primärer IECs.

Eine Isolation primärer IECs aus Hühnerembryonen am 20. Tag der Entwicklung führte zu einem niedrigeren Adhäsions- und Proliferations-Score verglichen mit der Isolation primärer IECs aus fünf bis 12 Wochen alten spezifisch-pathogen-freien (SPF) Hühnern des Legetyps. Darüber hinaus wurde die Adhäsion und Proliferation primärer IECs von SPF-Legehühnern mit primären IECs verglichen, die aus Broilern isoliert wurden. Obwohl der durchschnittliche Score von Broiler-IECs höher war als der durchschnittliche Score von SPF-IECs, wurden für die weitere Isolation SPF-Legehühner verwendet. Eine starke Mukusproduktion während der Isolation von Broiler-IECs führte zu bakterieller Kontamination und zu Schwierigkeiten in der Trennung des Mukus vom Zellmaterial.

Des Weiteren untersuchten wir den Einfluss zweier Inkubationstemperaturen (37°C und 41°C) auf die IEC-Kultur. Eine höhere Inkubationstemperatur führte zu einer schlechteren Adhäsion und Proliferation und zu Anzeichen zellulären Stresses (z.B. eine erhöhte Vakuolenanzahl im Zytoplasma).

Zusätzlich wurde der Einfluss verschiedener Zusätze und Konzentrationen zum Kulturmedium untersucht. Primäre Hühner-IECs, die mit fetalem Rinderserum anstelle von Hühnerserum kultiviert wurden, zeigten eine bessere Adhäsion und Proliferation. Das Hinzufügen von Hühnerembryoextrakt führte zu einer verminderten Anzahl adhärierender und proliferierender IEC-Cluster. Supplementierung des Kulturmediums für primäre Hühner-IECs mit Insulin, Fibronectin und Transferrin in Kombination mit der Verwendung industriell beschichteter Kollagen-Zellkulturplatten führte zu einer erfolgreichen und wiederholbaren Adhäsion und Proliferation primärer Hühner-IECs. Die Notwendigkeit einer Supplementierung dieser Komponenten demonstriert den hohen Anspruch primärer in vitro Zellkulturen epithelialer Herkunft.

Der epitheliale Charakter primärer Zellkulturen wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung des Zytokeratins bestätigt, welches ein intrazytoplasmatisches Zytoskelettprotein epithelialer Zellen ist. Außerdem wurde das transmembrane Protein E-Cadherin (epitheliales Cadherin), welches zur Gruppe der Adherens Junctions gehört, mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Über die Transmissionselektronenmikrsokpie (TEM) konnten wir zusätzliche IEC-Charakteristika wie Mikrovilli und Tight Junctions nachweisen.

Im zweiten Teil der Studie wurde in vitro die Virus-Wirt-Interaktion zwischen  einem niedrigpathogenen AIV (LPAIV) und velogenen viszerotropen NDV (vvNDV) mit primären Hühner-IECs untersucht. Dabei wurden die Replikationsdynamik und mRNS-Expression von Typ I und Typ III Interferonen (IFNs) nach einer Infektion mit niedrigpathogenem AIV (LPAIV) und velogenem viszerotropen NDV (vvNDV) sowie das mRNS-Expressionsmuster der IFN regulierten Gene (IRGs) IFIT 5 (IFN-induced protein with tetratricopeptide repeat 5) und ISG12 (IFN-stimulated gene 12) vier, 16 und 24 Stunden nach Infektion (hours post infection, hpi) näher untersucht. Als Vergleich zu einigen untersuchten Parametern wurden primäre Hühnerembryofibroblastkulturen (CEFs) eingesetzt. IECs und CEFs wurden mit einer niedrigen infektiösen Dosis (LID; Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01) oder hohen infektiösen Dosis (HID; MOI von 1) LPAIV H9N2 oder vvNDV Herts 33/56 infiziert.

Unsere Ergebnisse zeigten eine hohe Empfänglichkeit primärer Hühner-IECs gegenüber den in dieser Studie verwendeten LPAIV- und vvNDV-Stämmen. Virusreplikationsraten wurden mit Hilfe des Fokus Forming Unit- (FFU) und des Tissue Culture Infectious Dose 50- (TCID50) Tests bestimmt und zeigten einen klaren Unterschied zwischen LPAIV und vvNDV. Ein über 30-facher Anstieg der IFN-λ Expression nach einer Infektion primärer IECs mit LPAIV und vvNDV konnte beobachtet werden, während die Typ-I IFN mRNS-Expression nur leicht erhöht oder herunterreguliert war. 24 Stunden nach LPAIV-Infektion zeigte sich im Vergleich mit virusfreien Kontrollen eine bis zu 10-fache Veränderung der IFN-β mRNS-Expression. Dies deutet darauf hin, dass IFN-λ möglicherweise eine Rolle bei der Regulation von Viren in intestinalen Epithelzellen spielt. 

Die IRG-Expressionsmuster von IFIT5 und ISG12 nach einer LPAIV- und vvNDV-Infektion wiesen Unterschiede auf. IFIT5 und ISG12 waren nach einer LPAIV-Infektion primärer Hühner-IECs dosis- und zeitabhängig hochreguliert. Dahingegen war IFIT5 nach einer vvNDV-Infektion primärer Hühner-IECs nur leicht hochreguliert, während ISG12 herunterreguliert war. Dies deutet auf Unterschiede in der nachgeschalteten Regulierung der antiviralen Immunantwort zwischen beiden Viren hin.

Insgesamt wurde in dieser Studie eine reproduzierbare Methode für die Isolierung primärer Hühner-IECs etabliert, welche sich als geeignet für die Untersuchung bestimmter Aspekte einer AIV- und NDV-IEC Interaktion erwies. Zukünftig kann diese Isolationsmethode auch für die Isolation primärer IECs aus anderen aviären Spezies verwendet werden, um die Epidemiologie und Pathogenese dieser wichtigen Viren besser zu verstehen, aber auch um andere enterale Pathogene der Vögel in ihrer Interaktion mit IECs zu untersuchen.

abstract (englisch)

Avian influenza viruses (AIV) as well as Newcastle disease viruses (NDV) are a major health threat to poultry production worldwide. Both may cause severe clinical disease associated with high mortality. Respiratory epithelial cells were shown to be primary target cells for infection and replication. Most in vitro studies on AIV and NDV have focussed on organ cultures of the respiratory tract, while information regarding the virus-host interaction at the intestinal epithelial cell interface is lacking although a tropism of AIV and NDV to intestinal epithelial cells (IECs) has also been suggested. So far, only few studies have been described on the establishment of primary chicken IECs but protocols were variable and repeatable results difficult to obtain.

Therefore, the first objective was to establish a suitable primary chicken IEC model. By means of an IEC scoring system we compared different published IEC-isolation protocols, the influence of animal age, chicken genotype and incubation temperature on the attachment and proliferation of primary IECs and composition of culturing media.

Isolation of primary IECs from chicken embryos at embryonic day (ED) 20 led to lower attachment and proliferation score compared to isolation of primary IECs from five – 12 week old specific-pathogen-free (SPF) layer-type chickens. Furthermore, attachment and proliferation of primary IECs originating from SPF layer chickens were compared with primary cells isolated from broiler-type chickens. Although average scores from broiler-type chickens were higher than from SPF layer-type chickens, SPF-layer-type chickens were used for further isolation. Extensive mucous production during the isolation of broiler-IECs led to difficulties in separation of mucous from cell material and bacterial contamination.

Also, we investigated the influence of two incubation temperatures (37°C and 41°C) on IEC cultures. Higher incubation temperature resulted in poor proliferation, attachment and signs of cellular stress (e.g. increased number of vacuoles in the cytoplasm).

In addition, the influence of different media supplements and concentrations was evaluated. We observed an overall better attachment and proliferation of primary chicken IECs cultivated with fetal bovine serum instead of chicken serum. Also, addition of chicken embryo extract led to decreased numbers of attached and proliferating cell clusters. Supplementation of culturing media for primary chicken IECs with insulin, fibronectin and transferrin in combination with industrially collagen-coated cell culture plates led to successful and repeatable adhesion and proliferation of primary chicken IECs. The need of supplementation of these media components demonstrates the high demands of a primary in vitro cell culture of intestinal origin.

Epithelial character of the primary cell cultures was confirmed by immunofluorescence staining of cytokeratin, an intracytoplasmic cytoskeleton protein of epithelial cells, and staining of adherens junction transmembrane protein E-cadherin (epithelial cadherin). Additionally, transmission electron microscopy (TEM) verified additional characteristics of IECs such as microvilli and tight junctions.

The second objective of this study was to investigate virus-host-interaction of an AIV and a NDV in vitro with primary chicken IECs. The replication dynamics and mRNA expression of type I and type III interferons (IFNs) after infection with low pathogenic AIV (LPAIV) and velogenic viscerotropic NDV (vvNDV) as well as mRNA expression pattern of IFN stimulated genes (ISGs) IFN-induced protein with tetratricopeptide repeat 5 (IFIT5) and IFN stimulated gene 12 (ISG12) were evaluated at four, 16, and 24h post infection (hpi). For comparison, primary chicken embryo fibroblast cultures (CEFs) were used for some of the investigated parameters. IECs and CEFs were infected with a low infectious dose (LID; multiplicity of infection, MOI, of 0.01) or high infectious dose (HID, MOI of 1) of either LPAIV H9N2 or vvNDV Herts 33/56.

Our results showed high susceptibility of primary chicken IECs towards LPAIV and vvNDV strains used in this study. Viral replication rates were assessed by foci forming unit (FFU) assay and tissue culture infectious dose 50 (TCID50) assay and showed clear differences between LPAIV and vvNDV. An increase in IFN λ-expression of more than 30-fold was observed in IECs infected with LPAIV and vvNDV, while type I IFN mRNA expression was only slightly increased or downregulated with up to 10fold changes for IFN-β mRNA expression at 24h post LPAIV-infection compared to virus-free controls. This suggests a possible role of IFN λ in the control of viruses at the gut epithelial surface.

The expression patterns of ISGs IFIT5 and ISG12 differed between the infecting viruses. After LPAIV infection of primary chicken IECs, IFIT5 as well as ISG12 were upregulated in a dose and time dependent manner. On the other hand, infection of primary chicken IECs with vvNDV showed slight upregulation of IFIT5 and downregulation of ISG12. This indicates differences in the down-stream regulation of the antiviral immune response between infecting viruses.

Overall, a reproducible method for isolation of primary chicken IECs was developed which was shown to be suitable to investigate selected aspects of AIV- and NDV-IEC interaction. In the future, this isolation method can be also applied for isolation of primary IEC of other avian species, to understand more about the epidemiology and pathogenesis of these important viruses but also to investigate other enteric pathogens of birds in their interaction with IECs.

keywords

Aviäre Influenza, Huhn, intestinale Epithelzellen

kb

6.097