Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Deborah Elisabeth Joekel

 

 Rekombinante Antigene als Vakzinekandidaten gegen den Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus – in vitro Untersuchungen und Immunisierungsversuche

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107074

title (engl.)

Recombinant antigens as vaccine against the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus - evaluation of candidate proteins in vitro and vaccine trials

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/joekeld_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Der Rinderlungenwurm D. viviparus ruft schwere Infektionen in seinem Wirt hervor, die als parasitäre Bronchopneumonie oder Diktyokaulose des Rindes bekannt ist. Um die Tiere vor dieser Parasitose zu schützen und die erheblichen wirtschaftlichen Verluste zu minimieren, ist ein attenuierter Lebendimpfstoff in einigen europäischen Ländern verfügbar. Diese Vakzine hat jedoch eine Reihe von Nachteilen, weshalb die Entwicklung einer rekombinanten Subunit-Vakzine erstrebenswert wäre. Diese Arbeit verfolgte das Ziel der Entwicklung eines in vitro-Assays zur Evaluierung vielversprechender rekombinanter Vakzinekandidaten gegen D. viviparus. Solche Tests könnten dabei helfen, vielversprechende Impfkandidaten vor dem Einsatz im Tier auf ihre Immunogenität zu testen. Darüber hinaus wurde das Muskelprotein Paramyosin (PMY) rekombinant in E. coli und P. pastoris exprimiert (sog. EcPMY und PpPMY) und in drei klinischen Studien als rekombinanter Vakzinekandidat gegen den Rinderlungenwurm eingesetzt. Immunhistochemische Untersuchungen sollten überdies die Lokalisation von PMY im Körpergewebe von D. viviparus nachweisen.

Im Zuge der in vitro-Assays wurden verschiedene Immunzellpopulationen (PMBC, DC, T- Zellen) mit rekombinanten Lungenwurmproteinen (EcPMY, PpPMY, CPL, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG-1, LEG-2, MSP, NMT und PDI) stimuliert, um deren potentielle Eignung als Impfkandidaten zu analysieren. Die rekombinanten Proteine CPB-2, CPB-3, CPB’s, NMT, LEG-1 und LEG-2 konnten die PBMC-Proliferation nach in vitro Stimulation signifikant beeinflussen. Darüber hinaus resultierte die DC Stimulation und anschließende Co- Kultivierung mit autologen T-Zellen in einer signifikant erhöhten T-Zellproliferation im Falle von MSP, NMT, PpPMY, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG-1 und LEG-2. Nach PpPMY- Stimulation der DC zur Analyse der Expression von Zelloberflächen-Rezeptoren konnte eine signifikant erhöhte CD86-Expression beobachtet werden. Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse der Immunzell-Assays ist die Aussagekraft der durchgeführten Assays fraglich, da die ausgewählten Positivkontrollen Ovalbumin (OVA) bzw. E. coli-Lysat keine statistisch signifikante Stimulation der Zellen jedes Tieres induzieren konnten.

Die durchgeführten klinischen Vakzineversuche basierten auf dem Lungenwurm-Muskelprotein Paramyosin, welches in den immunhistochemischen Versuchen in der Muskulatur der Körperwand sowie in der Pharynxmuskulatur des Lungenwurmes nachgewiesen werden konnte. Das rekombinant exprimierte PMY wurde entweder mit dem Adjuvans Matrix-QTM oder Quil A in drei Vakzineversuchen in Rindern getestet. EcPMY+Matrix-QTM induzierte dabei unter Berücksichtigung des geometrischen Mittelwertes eine Reduktion der Wurmbürde von 36,11 %, PpPMY+Matrix-QTM von 20,66 % und PpPMY+Quil A von 18,37 %. Die Larvenausscheidung nach Vakzinierung mit PpPMY+Matrix-QTM sowie mit PpPMY+Quil A war um 43,65 % bzw. 22,60 % reduziert. Dahingegen resultierte die Vakzinierung mit EcPMY+Matrix-QTM in einer um 5,05 % erhöhten Larvenausscheidung. Statistisch signifikant kürzere weibliche Lungenwürmer (p=0,042) wurden infolge der EcPMY+Matrix-QTM-Impfung dokumentiert, sowie signifikant kürzere weibliche (beide Versuche p<0,001) als auch männliche (p=0,023; p<0,001) Würmer durch Impfung mit PpPMY+Matrix-QTM sowie PpPMY+Quil A. Die Antikörperentwicklungen nach ELISA-Untersuchungen zeigten bei den geimpften Rindern einen Anstieg der Antikörperklassen, insbesondere von IgG und IgG1 und zusätzlich von IgA durch PpPMY+Matrix-QTM und PpPMY+Quil A. Die Kontrolltiere hingegen zeigten keinen Anstieg von Antikörperklassen, die mit Ereignissen der klinischen Versuche in Zusammenhang gebracht werden könnten. Die PBMC-Assays an verschiedenen Zeitpunkten während der Vakzineversuche resultierten nach in vitro Stimulation mit rPMY in erhöhten Proliferationen nach der dritten Vakzinierung, nicht aber nach der Belastungsinfektion. Dies galt jedoch nicht für den Vakzineversuch mit PpPMY+Quil A, da hier zu keinem Zeitpunkt eine Proliferation detektiert werden konnte. Diese fehlende in vitro PBMC-Stimulation ist vermutlich auf das gewählte Adjuvans zurückzuführen. Der ausgebliebene „Boostereffekt“ auf die PBMC als auch die Antikörpertiter nach der Belastungsinfektion legt die Vermutung nahe, dass natives Lungenwurm-PMY ein sogenanntes hidden antigen darstellt. Zukünftig könnte rekombinantes PMY in Kombination mit anderen rekombinanten Lungenwurmproteinen getestet werden, um möglicherweise eine synergistische Wirkung zu erreichen.

abstract (englisch)

The bovine lungworm D. viviparus can lead to severe infection in its host commonly known as parasitic bronchopneumonia, husk or dictyocaulosis. To prevent cattle from clinical disease and minimize economic losses, an attenuated live vaccine is available in a few European countries. However, this vaccine has some disadvantages, why the development of a recombinant subunit vaccine would be desirable. This study aimed to establish an immunological in vitro assay to evaluate promising vaccine candidates of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus. Furthermore, the muscle protein paramyosin (PMY) was recombinantly expressed in E. coli und P. pastoris (referred to as EcPMY und PpPMY) tested for its protective potential as a recombinant subunit vaccine against the bovine lungworm. Immunohistochemistry was performed to localise PMY in the bovine lungworms tissues.

To analyse the potential suitability of several recombinant lungworm proteins (EcPMY, PpPMY, CPL, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG 1, LEG 2, MSP, NMT and PDI) as vaccine candidates, various immune cell populations (PMBC, DC, T-cells) were stimulated in vitro with mentioned proteins. The establishment of such assay systems would provide a valuable tool to screen promising vaccine candidates prior to their use in experimental vaccine studies. The recombinant proteins CPB-2, CPB-3, CPB’s, NMT, LEG-1 and LEG-2 significantly modified PBMC proliferation after in vitro stimulation. Furthermore, DC stimulation and co-cultivation of autologous T-cells resulted in a significant increased proliferation due to MSP, NMT, PpPMY, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG-1 and LEG-2. Expression of DC cell surface receptor CD86 was significantly enhanced after stimulation with PpPMY. Although the results of the immunological assays are promising, the significance of the immunological tests is debatable, since chosen positive controls ovalbumin (OVA) and E. coli-lysate, respectively, lacked significant cell-stimulation in each tested animal.

The clinical vaccination trials included the bovine lungworms muscle protein paramyosin as vaccine candidate, which was localised in the bodywall and pharyngeal muscles by immunohistochemistry. PMY was recombinantly expressed in E. coli and P. pastoris, combined with either the adjuvant Matrix-QTM or Quil A and used in three cattle vaccination trials. Based on geometric means, the performed trials resulted in decreased worm burdens of 36.11% for EcPMY+Matrix-QTM, 20.66% for PpPMY+Matrix-QTM and 18.37% for PpPMY+Quil A. Larvae sheddings was reduced by 43.65% by PpPMY+Matrix-QTM and 22.60% by PpPMY+Quil A whereas with EcPMY+Matrix-QTM larvae shedding was increased by 5.05%. Worm measurements resulted in significant shorter female worms with EcPMY+Matrix-QTM (p=0,042) as well as shorter males (p=0,023; p<0,001) and females (both trials p<0,001) with PpPMY+Matrix-QTM and PpPMY+Quil A, respectively. Antibody development analysed by ELISA showed that antibody values increases of mainly IgG and IgG1 and additionaly of IgA after immunisation with PpPMY+Matrix-QTM and PpPMY+Quil A. By contrast, the control groups did not show any antibody increase due to any event during the vaccination trials. PBMC assays at different time points during the vaccination trials resulted in considerably increased cell proliferation after the third vaccination, but not after challenge infection. However, vaccination with PpPMY+Quil A did not induce PBMC proliferation at any tested time point, which is probably attributable to the adjuvant Quil A. The absence of a booster effect on PBMC as well as antibody values after challenge infection leads to the assumption that native PMY is a “hidden antigen”. In future studies, PMY might be used in combination with other recombinant proteins to archieve a synergistic vaccination effect.

keywords

Dictyocaulus, rekombinante Vakzine, Immunzellassays; Dictyocaulus, recombinant vaccine, immunological assays

kb

5.693