Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 

 Heike Christine Anne Janssen

 

 

 Elektrophysiologische Untersuchung des Effektes neurotropher Behandlungen bei gehörlosen Katzen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108128

title (engl.)

Electrophysiological analysis of the effect of neurothropic treatment in deafened cats

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/janssenh_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Hören und Sprechen sind wichtige Kommunikationsmittel des Menschen und haben somit einen wichtigen Anteil an der geistigen und sozialen Entwicklung eines Menschen. Der Anteil der an Gehörlosigkeit erkrankten Menschen ist jedoch steigend. Hauptursache ist die angeborene oder erworbene sensorineurale Gehörlosigkeit (SNHL). Hierbei führt die Degeneration des Corti‘schen Organs zu einem von der Peripherie her voranschreitenden Verlust der Spiralganglienzellen (SGZ), die den Hörnerv bilden. Therapie der Wahl ist die Behandlung mittels eines Cochlea-Implantats (CI), welches die Funktion der Haarzellen, der Sinneszellen der Cochlea, ersetzt und den Hörnerv direkt stimuliert, um wieder einen Höreindruck zu ermöglichen. Dabei ist der Erfolg einer CI-Behandlung neben individuellen Faktoren des Patienten (z.B. Dauer der Ertaubung) und technischen Voraussetzungen des CI (z.B. Anzahl der Elektrodenkontakte) abhängig von der Anzahl der für eine elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden SGZ. Ein protektiver Effekt auf den Erhalt der SGZ konnte bereits durch eine Applikation neurotropher Faktoren (NTF), u.a. „glial cell line-derived neurotrophic factor“ (GDNF), auch in Kombination mit elektrischer Stimulation (ES) des CI, gezeigt werden. Bisher angewendete Applikationsmethoden haben jedoch nur eine begrenzte Wirkdauer (Einzelapplikation, osmotische Pumpen mit Speicherbehälter) oder stehen aufgrund ihrer Biosicherheit (genbasierte Therapie) in der Diskussion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine neue Behandlungsmethode gegen den voranschreitenden SGZ Verlust nach Ertaubung für den humanen Patienten auf ihre Sicherheit und Langzeitwirkung (d.h. SGZ-Erhalt) im Tiermodell zu testen (6 Monate), bevor diese in klinischen Studien eingesetzt wird. Der Schwerpunkt lag hierbei in der Untersuchung des Einflusses von fehlender neurotropher Versorgung und/oder fehlender Hörerfahrung auf die Funktionalität des Hörsystems. Die neue Applikationsmethode beinhaltete die Implantation eines speziell hergestellten Zylinders für das Innenohr, mit darin enthaltenen, genetisch veränderten, GDNF-produzierenden Zellen (engl. „encapsulated-cell“-Zylinder, EC-Zylinder). Vergleichbare EC-Zylinder mit der gleichen Zelllinie (humane, retinale ARPE 19 Zelllinie) wurden bereits zur Behandlung von Parkinson und Alzheimer im Gehirn des Menschen eingesetzt. Für den Versuch wurden neonatal ertaubten Katzen im Alter von 3 - 4 Monaten unilateral ein CI, zusammen mit einem EC-Zylinder in die Scala tympani implantiert. Eine Versuchsgruppe erhielt als Kontrolle einen EC-Zylinder mit der parentalen Zelllinie ohne GDNF-Produktion ( GDNF Gruppe), mit einer zweiten Versuchsgruppe wurde die alleinige Anwendung des neurotrophen Faktors GDNF untersucht (+GDNF Gruppe). Die dritte Versuchsgruppe erhielt eine kombinierte Behandlung aus GDNF und ES durch das CI (+GDNF/+ES-Gruppe). Diesen Versuchsgruppen wurden zwei Vergleichsgruppen gegenübergestellt: normal hörende Katzen (nach akuter Haarzell-Zerstörung) sowie kongenital taube Katzen (engl. „congenital deaf cats“, CDC). CDCs weisen aufgrund ihres längeren Erhalts cochleärer Strukturen gegenüber den pharmakologisch ertaubten Tieren eine verlangsamte SGZ-Degeneration auf und stellen somit eine Gruppe ohne Hörerfahrung, jedoch mit natürlicher neurotropher Versorgung dar. Zur Messung des protektiven Effektes in den Versuchsgruppen wurden nach einer Behandlungszeit von 6 Monaten die Cochleae nach Entnahme auf ihren Erhalt der SGZ histologisch ausgewertet. Zur Untersuchung der Funktion des Hörsystems wurden in einem Akutversuch bilateral CIs implantiert und elektrisch evozierte Hirnstammpotenziale (engl. „electrically evoked auditory brainstem response“, eABR) gemessen. Nach einer Implantationszeit von 6 Monaten konnte nur noch in einem von 9 EC Zylindern (+GDNF/+ES-Gruppe) eine, jedoch stark reduzierte, GDNF Produktion (13 % vom Ausgangswert) nachgewiesen werden. Die histologische Auswertung ergab in allen in situ verbliebenen EC-Zylindern (n = 6) ein Absterben der ARPE 19 Zellen sowie eine Einkapselung der EC-Zylinder durch fibrotisches Gewebe als Kennzeichen einer chronischen Entzündung. Die Füllung der Scala tympani mit fibrotischem Material war in der +GDNF Gruppe, im Vergleich zu den anderen Versuchsgruppen, im behandelten Ohr signifikant erhöht. Während die Kontrollgruppe (GDNF Gruppe) in 5 von 6 Fällen mehr SGZ auf der implantierten Seite zeigte (33 % mehr SGZ im implantierten Ohr), führte die alleinige Anwendung von GDNF (+GDNF Gruppe) in 5 von 6 Tieren zu einer beschleunigten SGZ Degeneration (25 % weniger SGZ im behandelten Ohr). Die chronische ES wurde für einen Zeitraum von im Mittel 48,67 ± 35,91 Stunden durchgeführt. Trotz dieser kurzzeitigen, initialen, kombinierten Anwendung von ES und GDNF führte die Kombination zu einem signifikant gesteigertem Erhalt der SGZ (66 % mehr SGZ im behandelten Ohr) und wirkte neuroprotektiv in allen Tieren der +GDNF/+ES Gruppe. Die Ergebnisse der Histologie deuten darauf hin, dass die Fibrose-Bildung zum Zelltod in dem EC-Zylinder führte und zudem in der +GDNF-Gruppe für den gesteigerten SGZ Verlust verantwortlich war. Die ES konnte vermutlich die vermehrte Fibrose-Bildung verlangsamen und somit den indirekt negativen Effekt des GDNF reduzieren. Die Untersuchung der Funktion des Hörsystems ergab kaum signifikante Unterschiede zwischen hörenden Tieren und CDCs. Die -GDNF Gruppe sowie die +GDNF Gruppe unterschieden sich jedoch signifikant von den hörenden Tieren, die -GDNF Gruppe in der Amplitude der späten Komponente IV, die +GDNF-Gruppe in der Latenz der späten Komponente IV sowie beide im Maximalwert der eABR Antwort (engl. „root mean square“, RMS). Dagegen konnten die Amplituden früher und späterer Komponenten sowie die maximalen RMS-Werte durch eine kombinierte Behandlung von ES und GDNF (+GDNF/+ES-Gruppe) qualitativ in Richtung der Werte von normal hörenden Tieren verschoben werden, blieben dabei jedoch unterhalb der Werte der CDCs und hörenden Tiere. Eine längere Stimulationszeit führte dabei zu signifikant höheren Amplituden und höheren maximalen RMS-Werten. Die Ergebnisse der Elektrophysiologie deuten darauf hin, dass die natürliche neurotrophe Versorgung auch ohne Hörerfahrung einen bedeutenden Einfluss nicht nur auf den Erhalt, sondern auch auf die Funktionalität des Hörsystems hat. Aufgrund der histologischen Ergebnisse kann vermutet werden, dass die ES die neuroprotektive Wirkung des GDNF ermöglichen konnte und somit die kombinierte Anwendung von ES und externer Versorgung mit GDNF synergistisch zu einer verbesserten Funktionalität des ertaubten Hörsystems führte. Der im Zusammenhang mit einer verstärkten Fibrose-Bildung stehende negative Effekt der GDNF-Behandlung indiziert den unterstützenden Einsatz antiinflammatorischer und antioxidativer Medikamente. Die hier vorgestellte Methode der kombinierten Behandlung mit GDNF und ES hat das Potenzial, bei Langzeitapplikation, protektiv sowohl auf den Erhalt, als auch auf die Funktionalität der SGZ zu wirken, und somit die Effektivität einer CI Behandlung im humanen Patienten zu erhöhen.

 

abstract (englisch)

Hearing and speaking are crucial for communication and therefore have a meaningful impact on the mental and social development of a human. However, the percentage of people suffering from hearing loss is increasing. In cases of sensorineural hearing loss (SNHL), the main cause of deafness, the degeneration of the organ of Corti leads to a subsequent and progressive degeneration of the spiral ganglion neurons (SGN), whose axons form the auditory nerve. The therapy of choice is the implantation of a cochlear implant (CI), which directly stimulates the SGN, therefore functionally replacing the degenerated sensory epithelium of the inner ear (i.e. the hair cells). In this context, the amount of SGN is, among other individual factors (e.g. duration of deafness) or technical issues (e.g. number of electrode contacts), a limiting factor for CI efficacy. Electrical stimulation (ES) through the CI and exogenous application of neurotrophic factors (NTF), as for example glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), singly or combined, are a promising intervention to reduce these degenerative processes. However, already established application methods can only be applied for a limited time (e.g. single-dose application or osmotic pumps with a drug reservoir) or are discussed with regard to bio-safety issues (gene-based treatment). The aim of the study at hand was to assess a new long-term application method (6 month) for NTF release in combination with a CI in terms of biological safety and chronic effect (i.e. SGN survival) in an animal study as a prerequisite for subsequent human application. The focus was to assess in how far the lack of neurotrophic support and/or the lack of hearing experience is influencing the functionality of the auditory pathway. The new application method consisted of an encapsulated cell (EC) device, which housed cells, genetically engineered for chronic secretion of GDNF. Similar devices with the same cell line (human retinal ARPE-19 cell line) have already been applied to the human brain in clinical studies of Parkinson’s and Alzheimer’s disease. For the study at hand, we co-implanted CI and EC device in the scala tympani of neonatally deafened cats. Two treatment groups with either GDNF treatment alone (+GDNF), or a combined ES and GDNF treatment (+GDNF/+ES) were compared with a group which lacked any neuroprotective treatment ( GDNF). In the latter case, the EC device contained the parental ARPE 19 cell line. These experimental groups were contrasted with two comparison groups: normal hearing cats (after hair cell destruction) and congenital deaf cats (CDC), representing a group without hearing experience but with natural neurotrophic support due to longer survival of the organ of Corti compared to pharmalogical-deafened cats. To assess the neuroprotective effect (i.e. SGN survival) in the experimental groups, cochleas were harvested for histological analysis at the end of the treatment period. To determine the functionality of the auditory system, CIs were bilaterally implanted in an acute setting and electrically evoked auditory brainstem responses (eABR) were measured. After the implantation time of 6 months, only one out of 9 tested EC devices (+GDNF/+ES) still showed a GDNF production, which was however markedly reduced (13 % of the pre-implantation level). The histological analyses revealed no cell survival of the ARPE-19 cells in those EC devices remaining in situ (n = 6). Additionally a tight encapsulation of the EC devices with fibrous tissue was found being an indicator for chronic inflammation. The formation of fibrous tissue was significantly enhanced in the treated ear of the +GDNF group, but not in the other experimental groups. While the control group (-GDNF) showed more SGN in the implanted ear in 5 out of 6 subjects (33 % more SGN in the implanted ear, compared to the contralateral ear), the sole application of GDNF (+GDNF) resulted in an acceleration of SGN degeneration in the treated ear in 5 out of 6 subjects (25 % less SGN in the treated ear). Chronic ES was applied on average for a duration of 48.67 ± 35.91 hours. Despite its restriction to a short initial time period, the combined application of ES and GDNF caused a significant increase in SGN survival (66 % more SGN in the treated ear) in all subjects of the +GDNF/+ES group. Based on the histological results, it can be proposed, that the encapsulation of the EC device with fibrous tissue led to cell death in the devices and to an accelerated SGN degeneration in the +GDNF group. The application of ES may have reduced the encapsulation of the EC device and thus allowed for a combined neuroprotective effect of ES and GDNF. The analysis of the functionality of the hearing system revealed rarely significant differences between hearing animals and CDCs. The GDNF as well as the +GDNF group differed significantly from the hearing group. The -GDNF group had significantly lower amplitudes of peak component IV, the +GDNF group had significantly longer latencies. Additionally, both groups had significantly lower maximal values in eABR measurements (root mean square, RMS) compared to the hearing group. The amplitudes of early and late eABR components as well as maximal RMS values of the +GDNF/+ES group were shifted towards values of normal hearing subjects but remained below the values of congenital deafened and hearing cats. The results of the electrophysiology indicate that natural neurotrophic support has significant impact, not only on the survival, but also on the functionality of the auditory pathway, even in the absence of hearing experience. Based on histology, it can be assumed that ES was allowing for the neuroprotective effect of GDNF and an additive effect of ES and GDNF on auditory function. Thus, exogenous application of neurotrophic factors combined with hearing experience via a CI can not only improve SGN survival, but also the functionality of the auditory system. The negative effect of GDNF which was related to enhanced fibrous tissue formation, is indicative for an additional treatment with anti-inflammatory and anti-oxidative drugs. The application method which was presented here has the potential to act neuroprotective on both SGN survival and function over a long time period and therefore is a promising tool to increase CI treatment efficacy in the human patient.

 

keywords

eABR, neurotrophe Behandlung, SGZ, eABR, neurotrophic treatment, SGN

kb

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