Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Kirsten Jahn

 

Excitotoxicity in ALS:

Investigations of underlying molecular mechanisms and evaluation of neuroprotective strategies

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-94956

title (ger.)

Exzitotoxizität als pathogenetisches Konzept der ALS: Untersuchungen zugrunde liegender molekularer Mechanismen und Bewertung neuroprotektiver Strategien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2007

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/jahnk_ws07.pdf

abstract (deutsch)

In der vorliegenden Arbeit wurde Exzitotoxizität als Ursache und möglicher Ansatzpunkt zur Behandlung der Amyotrophen Lateralsklerose untersucht.

Bei der Exzitotoxizität liegt ein Ungleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Transmsission zugunsten der exzitatorischen Transmission vor.

Insbesondere die exzitatorische Aminosäure Glutamat wird im Rahmen akuter Hirntraumata oder chronischen neurodegenerativen Erkrankungen vermehrt ausgeschüttet. Als Folge kommt es zu einer starken Aktivierung von AMPA Rezeptoren mit konsekutiver Überfrachtung der Zelle mit Kalziumionen. In Neuronen liegt die Kalziumkonzentration physiologischerweise im Bereich von 20 nM, im extrazellulären Raum hingegen bei ungefähr 300 mM. Viele Signalkaskaden in der Zelle benutzen Kalzium als Mediator, daher kann eine Störung der Kalziumhomöostase schwerwiegende Störungen des Zellmetabolismus und weiterer Zellfunktionen nach sich ziehen. Die intrazelluläre Kalziumkonzentration kann über diverse Kontrollmechanismen reguliert werden. Neben der Aufnahme und Abgabe über die äußere Zellmembran, kann Kalzium auch in intrazellulären Zellorganellen wie dem Mitochondrium und dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) zwischengespeichert und bei Bedarf von dort freigesetzt werden. Hierbei scheint insbesondere dem ER eine entscheidende Rolle zuzukommen. Durch Aktivierung sogenannter Ryanodin- Rezeptoren kommt es zu einer Freisetzung der Kalziumionen aus dem ER. Die Ryanodinrezeptoren können auch durch die Bindung von Kalziumionen aktiviert werden, so dass schon der Eintritt kleiner Kalziummengen aus dem Extrazellulärraum zu einer kaskadenartigen Freisetzung von Kalzium aus dem ER führen kann (Calcium- Induced Calcium Release, CICR).

Es ergeben sich dadurch zwei verschiedene Ansatzpunkte für eine mögliche neuroprotektive Strategie im Rahmen der Exzitotoxizität: eine Beeinflussung der Transmission und der intrazellulären Kalziumhomöostase.

Es ist beispielsweise bekannt, dass Riluzol eine neuroprotektive Wirkung hat und zwar durch die Beeinflussung sowohl der glutamatergen als auch der GABAergen Transmission. Daher war ein Ziel der Studie den molekularen Wirkmechanismus von Riuzol an beiden Rezeptorarten zu untersuchen, auch um evtl. Optimierungsmöglichkeiten einer neuroprotektiven Substanz zu finden.

Dantrolen ist ein Medikament, welches normalerweise bei der malignen Hyperthermie eingesetzt wird und zu einer Blockade von Ryanodinrezeptoren auf dem sarkoplasmatischen Retikulum in Muskelzellen führt. Genauso kann es ER- ständige Ryanodinrezeptoren in Neuronen inhibieren und somit die Kalziumfreisetzung aus dem ER in das Zytosol verringern. Unter exzitatorischen Bedingungen könnte dies einem neuroprotektiven Effekt gleichkommen. Daher wurde die neuroprotektive Eigenschaft von Dantrolen in Toxizitätsexperimenten überprüft und auch die Auswirkung dieser Substanz auf die intrazelluläre Kalziumhomöostase unter spontaner Aktivierung von AMPA- Rezeptoren im neuronalen Netzwerk untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass Riluzol am AMPA- Rezeptor sowohl zu einem kompetitiven als auch zu einem Offenkanalblock führt. An GABA- Rezeptoren konnten sowohl eine Potenzierung als auch ein Offenkanalblock nachgewiesen gewesen. Der Offenkanalblock könnte die protektiven Eigenschaften von Riluzol beschränken. Es wäre daher zu testen, ob eine Substanz, die am GABA- Rezeptor nur zu einer Potenzierung führen würde, einen deutlicheren neuroprotektiven Effekt hätte.

Intrazelluläre Kaziumtransienten konnten nach schnellen Natriumströmen beobachtet werden, die wiederum auf spontane AMPAerge EPSCs folgten und am ehesten im Sinne von Aktionspotentialen interpretiert werden können. Die Aktionspotentiale wiederum führten zur Öffnung von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen. Der Eintritt geringer Mengen von Kalziumionen durch diese Kanäle führt zu einer Aktivierung von Ryanodinrezeptoren und somit zu einer Freisetzung größerer Mengen Kalzium aus dem ER. Diese Kalziumtransienten konnten durch Dantrolen signifikant reduziert werden. In Toxizitätsexperimenten waren unter Kontrollbedingungen 27% der Zellen Motorneurone. Dieser Anteil wurde durch Kainat- Exposition auf 18% reduziert. Eine Kombination mit Dantrolen führte dazu, dass genauso viele Motoneurone wie in der Kontrollbedingung überlebten. Wurden die Neurone nur Dantrolen ausgesetzt, überlebten sogar mehr als in der Kontrollbedingung. Daraus kann gefolgert werden, dass Dantrolen durchaus neuroprotektive Eigenschaften zugeschrieben werden können. Allerdings würde sich in der Praxis das Problem der Applikationsart ergeben. Eine systemische Verabreichung würde dazu führen, dass die Muskelkraft durch eine Blockade der Ryanodinrezeptoren auf dem sarkoplasmatischen Retikulum zusätzlich geschwächt würde. Eine intrathekale Verabreichung ist nur schwer umsetzbar. Für eine therapeutische Strategie, die im Rahmen der Neurotransmission ansetzt (wie Riluzol) sollte die Kenntnis der Interaktion mit den wesentlichen Mitspielern der synaptischen Erregungsübertragung im ZNS die Ausgangslage für zukünftige Medikamentenentwicklungen sein. Dabei zeichnet sich zum einen eine gewisse Bedeutung inhibitorischer synaptischer Übertragung ab und eine Bevorzugung nicht- kompetitiver Blockmechanismen an erregenden Rezeptorkanälen.

 

abstract (englisch)

In summary our results indicate that intracellular calcium signalling in motoneurons depends on AMPA type GluR channel activation. This seems to be a more indirect process because presumed fast sodium currents which secondarily activate VGCC by the depolarizing stimulus precede the induction of ryanodine receptor dependent calcium release from the endoplasmic reticulum. Additionally, blockade of ryanodine receptors on the surface of the ER could prevent cell death in excitotoxic conditions. In this context an important question to answer would be how to apply the drug just into the CNS without affecting the muscles for clinical application in order to avoid loss of muscular power.

Another neuroprotective strategy aiming at modulation of AMPA-type receptor function is the application of Riluzole. We investigated its molecular mechanisms to find a possible starting point for optimization of its effectiveness. We found as a direct effect a competitive block mechanism and additionally an open channel block.

We also found marked effects of Riluzole on GABAA-receptor channels like potentiation of GABAergic currents and impact on current development and decay in the presence of the agonist. We could show for the first time that Riluzole leads to an open-channel block of GABAA-receptors activated by physiological concentrations of GABA. This effect could be counterproductive for the neuroprotective effectiveness of Riluzole as it reduces the inhibitory part in the homeostasis of inhibitory and excitatory transmission. Therefore this could be a starting point where to improve the pharmacological profile of a neuroprotective substance.

It is important to understand how neurons can be protected from excitotoxicity which is thought to play a crucial role in the pathogenesis of chronic neurodegeneration.

Especially with respect to the missing success of translation of preclinical neuroprotection achieved by a great variety of compounds during the last decade to the patients suffering from progressive neurodegenerative diseases like amyotrophic lateral sclerosis, the pharmacological research has to be addressed back to the molecular mechanisms of action being relevant for neuroprotection, and exact drug profiles have to be studied and compared to biological effects. Only a systematic research approach seems to be promising for the development of molecular drug design in this field of research.

 

keywords

Exzitotoxizität, Kalziumhomöostase, Riluzol; excitotoxicity, calcium homeostasis, riluzole

kb

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