Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Susanne Jäckel

Development of novel diagnostic assays for the detection and surveillance of Rift Valley fever virus infections in ruminants and camels

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106518

title (ger.)

Entwicklung neuer diagnostischer Methoden zum Nachweis und zur Überwachung von Rifttal-Fieber-Virus Infektionen in Wiederkäuern und Kamelen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/jaeckels_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Das Rifttal-Fieber-Virus (RVFV) gehört zur Familie der Bunyaviridae und ist ein vektorübertragenes zoonotisches RNA-Virus, das schwere, zum Teil tödliche hämorrhagische Fieber, Retinitis sowie Meningoenzephalitiden bei einem Prozent der humanen klinischen Fälle auslöst. Bei landwirtschaftlichen Nutztieren, insbesondere bei kleinen Wiederkäuern und Rindern sowie bei Kamelen, führt eine Infektion mit RVFV zu Fieber in Verbindung mit einer hohen neonatalen Morbidität und Mortalität. Ein charakteristisches Zeichen für eine Infektion mit dem RVFV ist ein massenhaftes Verlammen bei trächtigen Schafen und Ziegen, das als „abortion storm“ bezeichnet wird. Menschen können sich durch direkten Kontakt mit infektiösen Körperflüssigkeiten oder Gewebe von infizierten Nutz- oder Wildtieren infizieren.

Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist das Virus in Afrika und auf der Arabischen Halbinsel aufgetreten. Mehr als 30 Stechmückenarten, die auch in gemäßigten Klimazonen vorkommen, sind mögliche kompetente Vektoren für das Virus, sodass die ständige Gefahr einer Viruseinschleppung und -ausbreitung in nicht-endemische und/oder bislang nicht betroffene Länder besteht. Sowohl in Endemiegebieten mit regelmäßigen epizootischen Ausbrüchen als auch in bislang Rifttal-Fieber-freien Ländern müssen schnelle und gut funktionierende serologische und molekulare Nachweismethoden verfügbar sein, um zielgerichtete und schnelle Bekämpfungsmaßnahmen in aktuellen und zukünftigen Ausbrüchen durchführen zu können.

Ziel dieser Arbeit war es daher, neue diagnostische Nachweismethoden zu etablieren und zu validieren. Die Methoden konnten erfolgreich in einem aktuellen Ausbruchsgeschehen eingesetzt werden. Dabei wurden Serumproben von infizierten Tieren sowohl umfassend serologisch untersucht als auch RVFV-Isolate molekular charakterisiert.

RVFV-Strukturproteine (Nukleokapsidprotein NP sowie die Glykoproteine Gn und Gc) wurden bakteriell exprimiert, aufgereinigt und als Immunogene für die Herstellung von poly- und monoklonalen Antikörpern sowie als Antigen für serologische Testverfahren verwendet. Alle drei Proteine waren hoch-immunogen in Kaninchen und Mäusen, was die Generierung von poly- und monoklonalen Antikörpern ermöglichte. Insgesamt 45 ELISA-reaktive murine monoklonale Antikörper wurden mit Hilfe des Western Blots sowie eines adaptierten indirekten Immunfluoreszenztests weiter charakterisiert. 32 der Klone detektierten konformationelle Epitope der Virusproteine, was auch einen Einsatz der Antikörper für immunhistochemische Untersuchungen zur Antigendetektion ermöglicht. Ein gegen das Gn-Protein gerichteter monoklonaler Antikörper zeigte außerdem vielversprechende Ergebnisse in einem kompetitiven ELISA sowohl mit einem polyklonalen Kaninchenserum als auch mit Serumproben von RVFV-infizierten Schafen und Ziegen.

Da schon vier bis acht Tage nach einer Infektion mit dem Rifttal-Fieber-Virus Antikörper gegen beide Glykoproteine detektiert werden können, wurde ein neuer indirekter ELISA basierend auf Glykoprotein Gn entwickelt, welcher eine Alternative zu bisher publizierten und/oder kommerziell erhältlichen ELISAs darstellt, die das Nukleokapsidprotein als Antigen verwenden. Der direkte Nachweis von Gn- als auch NP-spezifischen Antikörpern ermöglicht somit auch den Einsatz von DIVA-Impfstoffen (Differentiating Infected from Vaccinated Animals), die sich aus Untereinheiten des RVFV zusammensetzen. Die Validierung des neuen Gn-ELISAs erfolgte mit fast 2000 Feldproben aus vier afrikanischen Ländern (Senegal, Mosambik, Uganda und Jemen). Alle Serumproben waren bereits vorher mit dem Virusneutralisationstest (VNT) getestet worden, der als Goldstandardmethode angesehen wird. Aufgrund der erreichten Sensitivität von 94,56% und einer Spezifität von 95,57% kann der Gn-ELISA als diagnostische Nachweismethode in Monitoring Untersuchungen eingesetzt werden. Die hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen des Gn-ELISAs und des Virusneutralisationstests zeigt, dass neutralisierende Antikörper vor allem gegen das Gn-Protein gerichtet sind.

Der neue Gn-ELISA wurde schließlich für die Untersuchung von 163 Serumproben verwendet, die von Dezember 2010 bis Februar 2011 während der späten Phase eines RVFV Ausbruchs in Mauretanien von kleinen Wiederkäuern, Rindern und Kamelen gesammelt worden waren.

Die Gesamtseroprävalenz bei diesen Tieren lag bei 57%. Hohe Übereinstimmung des Gn-ELISAs wurde in parallelen Untersuchungen mit adaptierten indirekten Immunfluoreszenztests und kommerziellen NP-basierten ELISAs erzielt. Der hohe Anteil von IgM-Antikörpern mit einer Prävalenz von fast 53% bei Schafen und Ziegen weist auf ein kontinuierliches Ausbruchs- und Verbreitungsgeschehen hin und bietet eine Erklärung für den erneuten RVF-Ausbruch im Jahr 2012.

Weiterhin konnte in vier der getesteten Kamelseren virale RNA mittels real-time PCR nachgewiesen werden, was die wichtige Rolle von Kamelen bei der Verbreitung und Vermehrung des Virus unterstreicht. Da Kamele in Mauretanien in engem Kontakt zum Menschen leben und auch ein wichtiges grenzüberschreitendes Transportmittel sind, stellen sie ein erhebliches Risiko für eine Virusübertragung dar.

Die hier beschriebenen neu entwickelten Nachweismethoden stellen wichtige Ergänzungen zu den bereits existierenden Methoden dar, was im Rahmen einer RVF Epidemie in Mauretanien gezeigt werden konnte. Aufgrund der Robustheit der entwickelten Testsysteme, mit denen außerdem auch schnelle und zuverlässige Ergebnisse zur Verfügung stehen, sind sie sowohl zur Anwendung in endemischen Regionen Afrikas als auch in bisher noch nicht betroffenen Ländern, zum Beispiel in Europa oder Nordamerika, geeignet.

abstract (englisch)

Rift Valley fever virus belongs to the family Bunyaviridae and is a vector-borne zoonotic RNA virus that can cause a severe and sometimes even fatal hemorrhagic fever, retinitis and meningoencephalitis in 1 % of the clinical human cases. In livestock, especially small ruminants and cattle, as well as in camels, the infection leads to fever associated with a high neonatal morbidity and mortality. Characteristic indications for a RVFV infection are so-called abortion storms among pregnant sheep and goats. Humans can become infected by direct contact to infectious body fluids or tissues of infected livestock or wildlife animals. Up to date, the virus is found in Africa and on the Arabian Peninsula. As more than 30 different mosquito species are possibly competent transmission vectors for RVFV and are also found in more moderate climate, there is a standing risk for an incursion and spread of the virus to currently non-affected countries including Europe. In endemic regions with regular epizootic outbreaks as well as in currently RVFV-free countries, fast and well functioning serological and molecular diagnostic assays are needed to facilitate quick and precise control measures in present or future acute outbreak situations.

The aim of this study was therefore to establish and validate novel diagnostic tools and assays for RVFV. The applicability of the methods was demonstrated in a recent RVF outbreak when a comprehensive serological analysis of serum samples from infected animals was carried out as well as a molecular characterization of RVFV isolates.

Structural proteins (nucleocapsid protein NP, glycoprotein Gn and Gc) were expressed in E.coli and used as immunogens for the production of poly- and monoclonal antibodies as well as utilized as antigens in diagnostic assays. All three proteins were highly immunogenic in rabbits and mice which allowed the generation of poly- and monoclonal antibodies. In total, 45 ELISA-reactive murine monoclonal antibodies were further characterized by Western blot and with an adapted indirect immunofluorescence test. 32 of them also recognized conformational epitopes of virus proteins so that they can potentially be used in immunohistochemistry for antigen detection. One of the mabs directed against glycoprotein Gn also showed promising results in a competition ELISA with polyclonal rabbit serum as well as with serum samples from RVFV infected sheep and goats.

As antibodies against both glycoproteins can already be detected four up to eight days after an infection with RVFV, a novel indirect ELISA based on glycoprotein Gn was established as an alternative to the already published or commercially available ELISAs using nucleocapsid protein as antigen. A direct detection of Gn- as well as NP-specific antibodies can facilitate the use of DIVA vaccines (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) which are usually composed of RVFV subunits. The new Gn based ELISA was eventually validated with almost 2000 field samples from four African countries (Senegal, Mozambique, Uganda and Yemen). These sera had been tested earlier by virus neutralization test which is considered as the gold standard method. The revealed sensitivity of 94,56% and specificity of 95,57% of the Gn ELISA is suitable for its use as diagnostic assay in monitoring studies. Interestingly, this close correlation between the Gn ELISA and VNT results indicates that neutralizing antibodies are primarily directed to the Gn protein.

The new Gn ELISA was eventually used for the analysis of 163 serum samples collected from small ruminants, cattle and camels from December 2010 to February 2011 during the late phase of a RVFV outbreak in Mauritania.

The overall RVFV antibody prevalence in these animals was 57%. Interestingly, the IgM prevalence for small ruminants was almost 53% which is indicative for a continuing outbreak and virus transmission events. Gn ELISA results were compared to data obtained by an adapted indirect immunofluorescence assay (IIFA) and to data obtained with commercial NP based ELISAs. Excellent correlations between the results of all assays used were found.

Moreover, in four of the camel sera viral RNA was detected by real-time PCR which underlines their importance for the amplification and transmission of the virus. As camels are living in close contact to humans in Mauritania and are important for transboundary transport, they can pose a considerable transmission risk.

In summary, the here described newly developed diagnostic tools and assays are a useful addition to already existing methods as could be shown in a RVF epidemic in Mauritania. As the novel test systems are robust, rapid and reliable they are suitable for the use in endemic African regions as well as in non-affected countries in Europe and North America.

keywords

Rifttal-Fieber-Virus,Diagnostik, Wiederkäuer, Rift Valley fever virus, diagnostics, ruminants

kb

370