Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Hermann Maximilian Iseringhausen

 

Die demyelinisierende kanine Staupeenzephalitis: Charakterisierung immunpathologischer Prozesse unter besonderer Berücksichtigung regulatorischer T-Zellen und der Apoptose

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103106

title (engl.)

Demyelinating canine distemper encephalitis: Characterization of immunopathological processes with special emphasis on regulatory T cells and apoptosis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/iseringhausenh_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Bei der Staupe handelt es sich um eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit des Hundes hervorgerufen durch das kanine Staupevirus, einem Morbillivirus aus der Familie Paramyxoviridae. Im Rahmen der Infektion kommt es zu einer ausgeprägten und langanhaltenden Immunsuppression und damit assoziierten schwerwiegenden respiratorischen, gastrointestinalen und/oder nervösen Symptomen. Beim Hund stellt die demyelinisierende Leukoenzephalitis die typische Manifestationsform der nervösen Staupe dar.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die regulatorischen T-Zellen (Treg) und die Apoptose bei der kaninen demyelinisierenden Staupeenzephalitis zu charakterisieren. Die Untersuchungen wurden an Klein- und Stammhirn-Proben der weißen Substanz von 28 natürlich mit CDV-infizierten Hunden und 5 Kontrolltieren durchgeführt. Es erfolgte eine Einteilung der Herdläsionen anhand des Staupevirus-Antigengehalts, der Zellularität, der Entzündungszellinfiltration, des Demyelinisierungsgrades und der glialen Reaktion in folgende 8 Gruppen: Kontrollareale (Gruppe 1), Virusantigen-freie Areale (Gruppe 2), Virusantigen-haltige Areale ohne offensichtliche Läsion (Gruppe 3), vakuolisierte Herde (Gruppe 4), akute Herde (Gruppe 5), subakute Herde ohne perivaskuläre Entzündung (Gruppe 6), subakute Herde mit perivaskulärer Entzündung (Gruppe 7) und chronische Läsionen (Gruppe 8). Bei der Gruppeneinteilung wurde zwischen einer prädemyelinisierenden Phase (Gruppen 2 bis 5) und einer demyelinisierenden Phase (Gruppen 6 bis 8) unterschieden.

Mittels histochemischer, immunhistologischer und immunfluoreszenzmikroskopischer Methoden wurde die Staupevirus-Verteilung, die gliale Reaktion (GFAP+ Astrozyten und Nogo-A+ Oligodendrozyten), die Myelinisierung, die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (Albumin und Aquaporin-4) und die Entzündungszellinfiltration (CD3+ T-Zellen, Foxp3+ Treg, CD79α+ B-Zellen, BS-1+ Makrophagen/Mikroglia, MAC 387+ Monozyten und MHC-II+ Antigen-präsentierende Zellen) untersucht. Darüber hinaus wurden apoptotische Zellen (aktivierte Caspase-3 und TUNEL-Reaktion) sowie unterschiedliche anti-apoptotische (Bcl-2, cIAP-2 und Survivin) und pro-apoptotische (Bax und Fas) Moleküle dargestellt.

In der Frühphase der demyelinisierenden Staupeenzephalitis wurde ein deutlicher Mangel an Foxp3+ Treg sowie eine Infiltration von CD3+ T-Zellen und eine erhöhte Anzahl von Makrophagen/Mikroglia festgestellt. Die Doppelimmunfluoreszenz zeigte Apoptosen überwiegend in CD3+ T-Zellen. Darüber hinaus wiesen Zellen mit Leukozyten-Morphologie eine erhöhte Expression des pro-apoptotischen Markers Fas auf. Die Ergebnisse der Frühphase weisen auf unzureichende immunmodulatorische Mechanismen aufgrund des Fehlens von Treg hin. Dies könnte auf eine Fas-vermittelte Apoptose Foxp3+ Treg zurückzuführen sein. Das Fehlen der Treg-assoziierten Gegenregulation begünstigt möglicherweise die Krankheitsinitiation und -progression.

Im Gegensatz dazu kommt es in der Spätphase der Staupeenzephalitis zu einer verzögerten Infiltration von Treg sowie zu einem drastischen Anstieg von CD3+
T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia. Die Expression des pro-apoptotischen Markers Fas in Leukozyten bleibt bis in die Spätphase bestehen. Zusätzlich wurde eine Aufregulation der anti-apoptotischen Moleküle Bcl-2 und Survivin in Zellen mit Gitterzell-Morphologie nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Spätphase kann angenommen werden, dass es trotz der Treg-Infiltration und der Fas-vermittelten Apoptose von Leukozyten, zu keiner effektiven Gegenregulation und damit Eindämmung der exazerbierten Entzündung kommt. Der Nachweis anti-apoptotischer Marker, insbesondere Survivin, in Gitterzellen könnte auf eine Apoptose-Resistenz hinweisen. Dies steht vermutlich mit einer reduzierten Elimination aktivierter Mikroglia und Makrophagen im Zusammenhang.

In einem weiteren Teil der Arbeit wurde Aquaporin-4 als Marker für Astrozyten und eine mögliche Störung der Blut-Hirn-Schrankenfunktion beim Hund etabliert. Darüber hinaus stellt Nogo-A einen neuen, validen Marker zum Nachweis kaniner Oligodendrozyten dar.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass die Apoptose und Treg im Verlauf der demyelinisierenden Staupeenzephalitis eine wichtige pathogenetische Rolle spielen. Folglich könnte der Gewebeschaden bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis durch drei phasenspezifische Mechanismen verursacht sein: a) ein Treg-Mangel, b) eine ineffektive Treg-vermittelte Immunmodulation und c) eine Apoptose-Resistenz pro-inflammatorischer Immunzellen. In weiteren Studien sollte der funktionelle Einfluss von enzephalitogenen und peripheren Treg auf die beteiligten Zellen sowie deren Interaktion im Rahmen der Staupevirus-Infektion näher untersucht werden. Darüber hinaus sollte in diesem Zusammenhang geklärt werden, welche Rolle die Apoptose oder Apoptose-Resistenz von Immunzellen spielt und welche möglichen therapeutischen Ansätze sich für virale Enzephalitiden beim Hund ergeben könnten.

 

abstract (englisch)

Canine distemper is an infectious and systemic disease of the dog with a worldwide distribution. The disease is caused by the canine distemper virus (CDV),
a morbillivirus of the Paramyxoviridae family. Following CDV-infection, dogs develop a severe and long-lasting immunosuppression associated with clinical signs of respiratory, gastrointestinal and/or central nervous disease. In the central nervous system (CNS) of dogs a demyelinating leukoencephalitis is the typical manifestation of CDV-infection.

Aim of the present study was to characterize regulatory T cells (Treg) and apoptosis during demyelinating canine distemper encephalitis. For the study, tissue samples of the cerebellum and brain stem originating from 28 naturally CDV-infected dogs and 5 non-infected control animals were examined. Based on the presence and amount of CDV antigen, cellularity, infiltration of inflammatory cells, level of demyelination and glial reaction, 8 different CNS lesion patterns were distinguished: control areas (group 1), areas lacking CDV antigen (group 2), areas containing CDV antigen without histopathological changes (group 3), areas of white matter vacuolization (group 4), acute lesions (group 5), subacute lesions without perivascular inflammation (group 6), subacute lesions with perivascular inflammation (group 7) and chronic lesions (group 8). The pre-demyelinating disease stage comprised groups 2 to 5 and the demyelinating disease stage included groups 6 to 8.

Applying histochemical, immunohistochemical and immunofluorescence-microscopical methods, CDV distribution, glial reaction (GFAP+ astrocytes and
Nogo-A+ oligodendrocytes), myelination, integrity of the blood-brain barrier (albumin and aquaporin-4) and inflammatory cells (CD3+ T-cells, Foxp3+ Treg, CD79
α+ B-cells, BS-1+ macrophages/microglia, MAC 387+ monocytes and MHC-II+ antigen presenting cells) were characterized. Furthermore, the presence of apoptotic cells (cleaved caspase-3 and TUNEL reaction) as well as different anti-apoptotic (Bcl-2, cIAP-2 and survivin) and pro-apoptotic (Bax and Fas) molecules were investigated.

In the early disease stage of demyelinating distemper encephalitis a significant lack of Foxp3+ Treg, an infiltration of CD3+ T-cells and increased numbers of macrophages/microglia were found. Using double immunofluorescence, apoptosis was primarily detected in CD3+ T-cells. In addition, an increased expression of the pro-apoptotic marker Fas was present in cells with leukocyte morphology. Thus, results of the early disease stage suggested the occurrence of insufficient immunomodulatory mechanisms due to the lack of Treg. This could be attributed to a Fas-dependent apoptosis of Foxp3+ Treg. Therefore, an absence of Treg-mediated counterregulatory mechanisms possibly facilitates disease initiation and progression.

In the late disease stage of demyelinating distemper encephalitis a delayed infiltration of Treg and a severe increase of CD3+ T-cells and macrophages/microglia were detected. Expression of pro-apoptotic Fas sustained within leukocytes. In addition, an up-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 and survivin was present in cells displaying gitter cell morphology. These data suggest that counterregulatory mechanisms in order to limit exacerbated CNS inflammation fail despite the presence of Treg and Fas-dependent leukocyte apoptosis. However, up-regulation of anti-apoptotic markers, especially survivin, in gitter cells may suggest an apoptosis-resistant phenotype, probably explaining a reduced elimination of activated microglia and macrophages.

Furthermore, within the context of this study, aquaporin-4 proved to be a suitable immunohistochemical marker for canine astrocytes and impairment of blood-brain barrier function. Furthermore, Nogo-A was established as an appropriate marker for the detection of mature oligodendrocytes in the canine CNS.

Results of the present study indicated that apoptosis and Treg play an important pathogenetic role in the course of demyelinating canine distemper encephalitis. Therefore and based on these data, tissue damage due to naturally occurring CDV-infection can be based on three disease stage-specific mechanisms: a) a lack of Treg, b) an ineffective Treg-dependent immunomodulation and c) an apoptosis-resistant phenotype of pro-inflammatory immune cells. Further studies should elucidate the functional role and impact of encephalitogenic and peripheral Treg upon immune cells as well as their interaction during CDV-infection. Moreover, the role of apoptosis or apoptosis resistance of immune cells and thus possible therapeutic approaches targeting viral encephalitis in the dog should be addressed.

 

keywords

Staupe; regulatorische T-Zellen; Apoptose, distemper; regulatory t cells; apoptosis

kb

5.002