Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Marina Ille

Auswirkungen von Soja und Grassilagen mit unterschiedlichen Reineiweißgehalten auf den ruminalen Eiweißstoffwechsel in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109863

title (eng.)

Effects of soy protein and grass silages containing different levels of true protein on ruminal protein metabolism in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/illem_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Mangelnde Gesundheitszustände in Milchviehherden mit unspezifischen Symptomen („Faktorenerkrankung Milchviehherde“) werden oftmals mit der Verfütterung von Grassilagen mit einem prozentualen Reineiweißanteil (RE) am Rohprotein (Rp) von unter 50 % assoziiert. Ein veränderter ruminaler Proteinmetabolismus kann zu Verschiebungen innerhalb des bakteriellen Mikrobioms im Pansen führen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Auswirkungen von solchen veränderten Grassilagen (RE/Rp < 50 %) und Soja auf den ruminalen bakteriellen Eiweißstoff-wechsel bzw. auf spezifische Aktivitäten der Enzyme Dipeptidylpeptidase I (DPP I; EC 3.4.14.1) und Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV; EC 3.4.14.5) zu untersuchen.

Während insgesamt acht Versuchsdurchgängen wurden mit Hilfe des RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique) verschiedene Grassilagen mit und ohne Sojazulage über jeweils 28 Tage Laufzeit hinweg untersucht, wobei je vier Versuchsdurchgänge zu einem Laufblock (Lauf 31–34 und Lauf 35–38) zusammengefasst wurden und pro Laufblock eine Schadgrassilage (RE/Rp < 50 %) mit einer Kontrollsilage (RE/Rp > 50 %) derselben landwirtschaftlichen Fläche verglichen wurde. Dabei bestand jeder Lauf aus Einlauf- und Kontrollphase, Zulagephase und Erholungsphase. Einlauf- und Kontrollphase dienten zur Stabilisierung des Systems bei Fütterung von Kontrollsilage und Stärke. Während der Zulagephase wurde in den Testfermentern Kontrollsilage durch Schadsilage und Schadsilage mit Sojazulage ersetzt, während stets zwei Fermenter pro Lauf durchgängig Kontrollsilage und Stärke erhielten. In der abschließenden Erholungsphase wurden alle Fermenter wieder auf Kontrollsilage und Stärke umgestellt, um zu überprüfen, ob sich der Ausgangszustand wieder herstellen ließ.

Täglich wurde der pH-Wert mittels Elektrode erfasst. Die Gehalte bakteriellen Pro-teins in der Fermenterflüssigkeit wurden photometrisch nach BRADFORD (1976) bestimmt. Zur Messung der Aktivitäten von DPP I und IV wurde eine Methode zur direkten Bestimmung der Substratbruchstücke via LC/MS (engl. liquid chromato-graphy/mass spectrometry; Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie) entwickelt. Hierbei wurden Proben der Fermenterflüssigkeit mit den Substraten Gly-Arg-4-methoxy-ß-naphthylamide dihydrochloride (Gly-Arg-MNA; typisches Substrat für DPP I) und Z-Gly-Pro-4-nitroanilide (typisches Substrat für DPP IV) versetzt und bei 39 °C für 24 h inkubiert. Nach Analyse der Proben mittels LC/MS wurden die durch die enzymatische Spaltung entstandenen Substratbruchstücke (Dipeptid + Farbstoff) ausgewertet und somit überprüft, ob und wie die Enzyme DPP I und IV ihre bestimmten Substrate hydrolysiert hatten. Die Variationskoeffizienten in Serie lagen für die verschiedenen Stoffe zwischen 1,30 % und 9,40 %.

Durch die Zulage von Schadsilage und Soja (Tag 11–19) wurde der pH-Wert in Lauf 35–38 leicht beeinflusst (+0,81 % im Vergleich zur Kontrolle), blieb insgesamt aber weitestgehend stabil. Während die Gehalte bakteriellen Proteins in Lauf 31–34 unter Zulage von Schadsilage absanken (-10,8 %), stiegen sie in Lauf 35–38 während der Zulagephase (Tag 11–19) deutlich über das Niveau der Kontrolle (+30,8 %), wobei jeweils kein zusätzlicher signifikanter Einfluss von Sojaprotein festgestellt werden konnte.

Der Abbau des DPP-I-Substrates Gly-Arg-MNA spiegelte sich grob im Vorkommen seines Farbstoffrestes 4-Methoxy-ß-naphthylamide (4-MNA) wider: Im ersten Ver-suchsdurchgang (Lauf 31–34) wurde vor allem bei Zulage von Schadsilage und Soja im Vergleich zur Kontrolle mehr Gly-Arg-MNA abgebaut (+45,5 %) bzw. mehr 4-MNA aufgefunden (+63,4 %), wohingegen während des zweiten Laufblocks (Lauf 35–38) durch Schadsilagefütterung und Sojazulage jeweils starke Anstiege des Abbaus von Gly-Arg-MNA (+74,5 % bis +93,1 %) bzw. des Vorkommens von 4-MNA (+113 % bis +131 %) auftraten und Abbau und Vorkommen sich auch nach Ende der Zulagephase bis Versuchsende dem Level der Kontrolle nicht mehr annäherten. Die Bruchstücke Z-Gly-Pro und 4-Nitroaniline (4-NA) des DPP-IV-Substrates Z-Gly-Pro-4-nitroanilide traten in Lauf 31–34 bei Zulage von Schadsilage um +17,6 % (Z-Gly-Pro) bzw. +5,13 % (4-NA) häufiger auf und nahmen unter Soja nochmals zu (+44,8 % bzw. +41,0 %). Im zweiten Laufblock trat dieser Effekt verstärkt auf: Bei Zulage von Schadsilage stieg das Vorkommen von Z-Gly-Pro auf +61,8 %, bei Zulage von Soja auf +82,5 % im Vergleich zur Kontrolle während Tag 11–19. Ähnlich verhielt sich 4‑NA (+66,5 % bei Schadsilage; +95,7 % bei Schadsilage und Soja), wobei sowohl das Vorkommen von Z-Gly-Pro als auch von 4-NA in Lauf 35–38 in der Erholungsphase nicht mehr auf Kontrollniveau absank.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich Schadsilagen mit RE/Rp < 50 % und Soja auf die ruminale Dipeptidolyse auswirken und eventuell eine Populationsverschiebung verursachen. Diskutiert wurden mögliche Einflüsse von Schadsilagen und Soja auf die Aktivitäten proteolytischer Enzyme, auf die häufigste ruminale Bakteriengattung Prevotella sp. und auf weitere Vertreter des bakteriellen Mikrobioms im Pansen. Dabei war eine Steigerung des Abbaus der Testsubstrate durch gesteigertes Wachstum bzw. erhöhte Aktivität von Prevotella sp. in mit veränderter Silage beladenen Fermentern denkbar. Die Ursachen des unspezifischen Krankheitsbildes sowie der positiven Wirkung von Soja konnten nicht endgültig dargelegt werden. Die Forschungsfelder Microbiomics und Metagenomics sowie die Erforschung ruminaler Stoffwechselwege und beteiligter Enzymsysteme mittels sequenzbasierter Analyse mikrobieller Sammelgenome sollten in Zukunft im Vordergrund stehen.

abstract (englisch)

Poor health in dairy cattle herds with unspecific symptoms (‘Faktorenerkrankung Milchviehherde’ – ‘factorial disease of dairy herds’) is often associated with the feeding of grass silages containing less than 50 % true protein in total crude pro-tein (TP/CP). Changes in ruminal protein metabolism can lead to shifts within the bacterial rumen microbiome.

The aim of this study was, therefore, to examine the impact of these altered, suspect-ed grass silages (< 50 % TP/CP) and soy protein on ruminal bacterial protein metab-olism, respectively on specific activities of enzymes dipeptidyl-peptidase I (DPP I; EC 3.4.14.1) and dipeptidyl-peptidase IV (DPP IV; EC 3.4.14.5).

During in a total of eight digestive experiments using the RUSITEC (RUmen SImulation TEChnique), different grass silages were tested with and without added soy protein over 28 days runtime. Four experiment runs were pooled into one run block (runs 31–34 and runs 35–38), respectively, whereas during each run block a grass silage with < 50 % TP/CP was compared to a control silage with > 50 % TP/CP, both harvested from the same field. Each run consisted of 3 stages: The initial stage to stabilize the system while feeding control silage (> 50 % TP/CP) and starch, followed by the trial stage where starch and grass silage (< 50 % TP/CP) were fed with and without added soy protein. The final stage showed whether the system would recover when control silage and starch were fed again. Each time, two fermenters stayed on control silage feeding for the whole 28 days.

The pH of the ruminal fluid was measured daily via electrode, as well as the content of bacterial protein using the photometric BRADFORD (1976) assay. A method was developed to measure the specific activities of enzymes DPP I and IV by assessing substrate fragments directly via LC/MS (liquid chromatography/mass spectrometry). Samples of rumen fluid were mixed with the substrates Gly-Arg-4-methoxy-ß-naphthylamide dihydrochloride (Gly-Arg-MNA; indicator substrate for DPP I) and Z‑Gly-Pro-4-nitroanilide (indicator substrate for DPP IV) and incubated at 39 °C for 24 h. The samples were analyzed via LC/MS and investigated for the different sub-strate fragments (dipeptide + dye) to check if and how the enzymes had broken down their particular substrate. The coefficients of variation in series for the different substrates and fragments were between 1.30 % and 9.40 %.

By adding grass silage (< 50 % TP/CP) and soy, the pH of the ruminal fluid was slightly affected during days 11–19 of runs 35–38 (+0.81 % compared to control), but mostly stable. While the contents of bacterial protein were lowered during runs 31–34 by feeding suspected grass silage (-10.8 %), there occurred a notable increase (+30.8 %) in contents of bacterial protein during runs 35–38 in fermenters fed grass silage containing < 50 % TP/CP, with no additional significant impact of added soy protein in both run blocks.

Degradation of DPP I substrate Gly-Arg-MNA reflected occurrences of its dye residu-al 4-Methoxy-ß-naphthylamide (4-MNA): During the trial stage of runs 31–34, sus-pected grass silages caused an increase in degradation of Gly-Arg-MNA (+45.5 % compared to control) and higher occurrences of 4-MNA (+63.4 %) especially when soy protein was added, whereas stronger increases in degradation of Gly-Arg-MNA (+74.5 % and +93.1 % with added soy protein) and occurrences of 4 MNA (+113 % and +131 % with added soy protein) were seen in the second run block. Here, neither degradation of Gly-Arg-MNA nor occurrences of 4-MNA returned to control level after the trial stage. Fragments Z-Gly-Pro and 4-Nitroaniline (4-NA) of DPP IV substrate Z‑Gly-Pro-4-nitroanilide were found more often when grass silages (< 50 % TP/CP) were fed during the first run block (+17.6 % and +5.13 %, respectively), while added soy protein further increased this effect (+44.8 % and +41.0 %, respectively). Even higher occurrences were seen in runs 35–38 with +61.8 % for Z-Gly-Pro (+82.5 % with added soy protein) and +66.5 % for 4-NA (+95.7 % with added soy protein, compared to control). The occurrences of Z-Gly-Pro and 4-NA did not go back to control level when control silage was fed again.

This study revealed the influence grass silages containing < 50 % TP/CP and soy protein exert on ruminal dipeptidolysis by possibly causing a shift in the rumen microbiome. Potential impacts of these grass silages and soy protein on proteolytic enzyme activity, on the most abundant ruminal bacterial genus Prevotella sp. and on several other members of the rumen microbiome were discussed. An increased degradation of test substrates through enhanced growth or higher activities of Prevotella sp. in fermenters fed altered grass silages seemed possible. The causes of the unspecific clinical picture and the reasons for the positive effects of soy protein could not be resolved conclusively. Future research should focus on the fields of microbiomics and metagenomics as well as on studying ruminal metabolism pathways and involved enzyme systems via sequence-based analysis of microbial collective genomes.

keywords

Pansen, Prevotella, Dipeptidylpeptidase, Rumen, Prevotella, dipeptidyl peptidase

kb

2.078