Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Mareike Hütten

Untersuchungen zur Neuroprotektion und Fibrosereduktion bei Cochlea-Implantat-Anwendung

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95- 105579

title (engl.)

Studies on neuroprotection and fibrosis reduction in cochlear- implant application

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/huettenm_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel der vorliegenden Studie war die Optimierung von Cochlea-Implanteten (CIs) auf Basis zweier Ansatzpunkte: Spiralganglienzellerhaltung mittels zellbasierter Theapie mit brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und Reduktion der periimplantären Fibrose durch den Einsatz eines neuartigen Medikamenten-Reservoirs. Hierfür wurden BDNF im Zellversuch an Spiralganglienzellen (SGZ) und ein mit Dexamethason (DEX) befülltes Hydrogel in In-vivo-Versuchen am Innenohr von Meerschweinchen getestet.

 

In den entsprechenden Versuchen wurden BDNF-produzierende NIH3T3/BDNF-Fibroblasten in ein Ultra-high-viscosity-Alginat (UHV-Alginat) eingebettet. In regelmäßigen Intervallen wurde nach Anfertigung von Kryostatschnitten das Wachstumverhalten jener Fibroblasten mikroskopisch untersucht. Zu jedem Kontrollzeitpunkt waren die Fibroblasten homogen im Alginat verteilt. Nach 24 bzw. 48 Stunden waren im Alginat ausschließlich einzeln liegende Zellen sowie Zellansammlungen von bis zu 5 Zellen zu finden, nach 7 bis 30 Tagen waren dagegen, trotz leicht gesunkener Zellzahl, vor allem große Zellverbände vorhanden.

Die während des Versuchszeitraums freigesetzten Mengen an BDNF wurden durch ELISAs ermittelt. Nach initialer Abnahme des Wertes stieg ab Tag 2 die BDNF-Konzentration bis Tag 30 kontinuierlich und mit einem p-Wert von <0,01 im Vergleich zum 48-Stunden-Wert signifikant an.

Gleichzeitig wurde auch der biologische Effekt des gebildeten BDNF getestet, indem eine primäre Spiralganglienzellkultur mit dem Überstand der UHV-Alginat-NIH3T3/BDNF-Kultur inkubiert und die Zellzahl bestimmt wurde. Als Negativkontrollen dienten zum Einen SGZ mit Zusatz von UHV-Alginat-Überstand ohne Zellbesatz, zum Anderen SGZ in reinem Medium ohne Additiva. Als Positivkontrolle wurde eine Spiralganglienzellkultur hinzugezogen, die mit 50 ng BDNF/ ml beimpft wurde.

Die Überlebensrate von SGZ, die mit 50 ng/ ml BDNF oder dem Überstand von UHV-Alginat ohne Fibroblasten versehen worden waren, lag signifikant höher als die Überlebensrate der Zellen der Negativkontrolle mit reinem Nährmedium. Die Zellkultur, die mit dem Überstand von 7 Tage lang inkubiertem UHV-Alginat-NIH3T3/BDNF behandelt worden war, erreichte sogar eine Überlebensrate, die höher war als die Summe der Raten der mit dem Überstand puren Alginats inkubierten SGZ und der mit 50 ng/ ml BDNF behandelten Zellen. Damit erzielte sie eine signifikant höhere neuronale Zellprotektion als alle anderen Gruppen (p<0,001).

 

Es kann geschlussfolgert werden, dass der Verbund aus UHV-Alginat und NIH3T3/BDNF-Fibroblasten allen Anforderungen gerecht wurde: Über den gesamten Versuchszeitraum von 30 Tagen waren Zellen in der Matrix nachweisbar, was für Proliferation und Lebenserhaltung der Fibroblasten innerhalb des Alginats spricht. Bildung und Freisetzung von BDNF konnten in der Konzentrationsmessung mittels ELISA ebenfalls nachgewiesen werden. Bei der Inkubation der SGZ mit Überstand von mit Fibroblasten beimpften Alginat stellte sich sogar ein synergistischer neuroprotektiver Effekt heraus.

Weitere Untersuchungen sollten sich der zellbasierten Therapie mittels UHV-Alginat in Verbindung mit NIH3T3-Zellen widmen. Dabei sollten Techniken entwickelt werden, mit denen eine präzise, schnelle und sterile Ummantelung von CIs unter Schutz der Fibroblasten geschehen kann. Ferner sollte der Unterschied zwischen Laborbedingungen und Operationssaal bedacht und nachfolgend eine mögliche Erhöhung der Impedanzen berücksichtigt werden.

 

In den Versuchen, die sich mit der DEX-Applikation aus Hydrogelreservoiren befassten, sollte die Anwendbarkeit des NCO-sP(EO-stat-PO)-Hydrogels zur Freisetzung des DEX über mehrere Wochen getestet werden. Normalhörenden Dunkin-Hartley-Meerschweinchen wurden entweder Hydrogelreservoire mit DEX oder Hydrogelreservoire mit PBS implantiert oder aber Reservoire unmittelbar nach der Einführung ins Innenohr wieder entfernt, so dass hier lediglich der traumatische Einfluss der Manipulation zu bewerten war.

Hörtests und die Mikroskopie von in Epoxidharz eingebetteten und geschliffenen Gewebspräparaten zeigten einen signifikant geringeren Hörverlust und eine weniger stark ausgeprägte Fibrose der mit Hydrogelreservoir + DEX behandelten Cochleae im Vergleich zu beiden Kontrollgruppen. Hingegen wiesen die Cochleae der Trauma-Gruppe bedenkliche funktionale und morphologische Veränderungen auf. Es muss davon ausgegangen werden, dass die zusätzliche Manipulation innerhalb der Cochlea einen schädlicheren Einfluss besitzt als das in der Scala tympani fixierte und damit als Fremdkörper wirkende Hydrogelreservoir. Die Ergebnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass das NCO-sP(EO-stat-PO)-Hydrogelreservoir als vielversprechende Langzeitapplikationshilfe für wasserlösliche Stoffe in therapeutisch wirksamen Konzentrationen im Bereich des Innenohrs einsetzbar ist. Möglicherweise könnte das Hydrogel in Kombination mit CIs auch als nachbefüllbare Version zum Einsatz kommen. Auf diese Weise könnte der ohnehin unausweichliche chirurgische Eingriff während der CI-Implantation dazu genutzt werden, das Hydrogel ins Innenohr einzuführen. Noch während der Operation könnte über die Art der Befüllung entschieden und postoperativ durch Nachfüllung eine andauernde Medikation durchgeführt werden.

 

abstract (englisch)

Aim of the dissertation at hand was the optimization of cochlear-implant (CI) usage in terms of two approaches: spiral-ganglion-cell (SGC) sustainment due to cell-based brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) therapy and reduction of periimplantational fibrosis via a novel drug-delivery reservoir. Therefore, BDNF was tested in in-vitro experiments with SGCs and a hydrogel filled with dexamethasone (DEX) was tested in vivo in the inner ears of guinea pigs.

 

In BDNF-related experiments, BDNF-producing NIH3T3 fibroblasts were embedded into an ultra-high-viscosity alginate (UHV-alginate). Their proliferational behaviour was controlled via microscopical evaluation of cryostat slices in regular time intervals. During the entire experiment, the fibroblasts were distributed homogenously inside the alginate. 24 hours, respectively 48 hours after embedding, only solitary cells or cell accumulations of up to 5 cells were found in the alginate. Despite decreasing total cell number, from day 7 to day 30, fibroblasts had built large clusters.

The amount of released BDNF was detected via ELISA. After initial reduction, the BDNF concentration increased continuously until day 30 with a p-value of <0.01 when compared to the BDNF concentration on day 2. The biological effect of BDNF produced from UHV-alginate-NIH3T3-fibroblasts was evaluated by incubating a primary SGC culture with the supernatant of the cell culture and monitoring the cell number. SGCs with the supernatant of UHV-alginate without fibroblasts and SGCs in pure medium without additives served as negative controls. A positive control was built by a SGC culture inoculated with 50 ng/ ml BDNF.

Survival of SGCs incubated with 50 ng/ ml BDNF or the supernatant of UHV-alginate without fibroblasts was significantly higher than cell survival of SGCs of the negative control with pure medium. The cell culture, which was treated with the supernatant of UHV-alginate-NIH3T3/BDNF incubated for 7 days, reached a survival rate higher than the sum of survival rates of SGCs incubated with supernatant of alginate without fibroblasts and of cells treated with 50 ng/ ml BDNF. Thus, it attained a significantly better neuronal protection than all other groups (p<0.001)

In summary, the combination of UHV-alginate and NIH3T3-fibroblasts satisfied all requirements: during the whole experimental time of 30 days, cells were detectable in the alginate matrix, which confirms survival and even proliferation within the alginate. Production and release of BDNF was also verified and concerning the incubation of SGCs with the supernatant of alginate with fibroblasts an even synergistic effect emerged.

Further steps should attend to establish a cell-based therapy using UHV-alginate in combination with NIH3T3-cells. Further, techniques should be invented to allow a precise, fast and sterile coating of CIs while preserving the NIH3T3 protection. Distinctions between laboratory conditions and operating room and consequently a possible increase of impedances should be considered.

 

In the study concerning the DEX application through hydrogel reservoirs, the applicability of NCO-sP(EOstat-PO) hydrogel for sustained DEX release over several weeks was tested. Using normal hearing Dunkin-Hartley guinea pigs, either hydrogel reservoirs with DEX or hydrogel reservoirs with PBS were implanted or the reservoir was extracted immediately after insertion in order to assess the traumatic impact of manipulation.

Audiometry and microscopy of tissue specimens showed significantly reduced hearing loss and less distinct fibrosis of cochleae treated with hydrogel reservoir + DEX in comparison to both control groups. In contrast, considerable functional and morphological changes were detected in the trauma group. It must be assumed that the additional movement inside the cochlea is even more destructive than the hydrogel reservoir, which remained fixated inside the Scala tympani and thus functioned as a foreign body.

The results suggest that the NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel is a promising long-term drug- delivery device to apply water-soluble drugs in therapeutically relevant doses to the inner ear. Potentially, the hydrogel could be combined with CIs in terms of a rechargeable alternative of a drug-delivery device. With this method, the inevitable surgery for CI implantation could be used to insert the hydrogel into the inner ear. The kind of charging could be decided on during surgery and a post-operative long-term medication could be realised.

 

keywords

Cochlea, Fibrose, Spiralganglienzelle, cochlea, fibrosis, spiral ganglion cell 

kb

165