Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Yidan Huang

Epidemiological Study on Yersinia ruckeri Isolates from Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in North West Germany

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103989

title (ger.)

Eine epidemiologische Studie an Yersinia ruckeri-Isolaten aus Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in Nord-West Deutschland

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/huangy_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Yersinia ruckeri, der Erreger der Rotmaulseuche (Enteric Redmouth Disease,ERM), ist eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten in der Regenbogenforellenzucht in Europa. Obwohl im allgemeinen Y. ruckeri gut durch Impfungen und Antibiotikabehandlungen kontrolliert werden konnte, waren Ausbrüche dieser Krankheit noch regelmäßig zu beobachten, vor allem in endemischen Gebieten. Darüber hinaus scheinen einige Y. ruckeri Stämme nicht auf bestimmte kommerzielle Impfstoffe zu reagieren. Alle diese Stämme waren unbeweglich, während in früheren Ausbrüchen isolierte Stämme von beweglich waren. Es wurde vermutet, dass die Impfung einen selektiven Druck auf die Bakterien ausübt, der das Entstehen von nicht beweglichen Stämmen ermöglichte, die gegen die kommerziellen Vakzine unempfindlich sind. Daher besteht ein hohes Risiko, dass sich diese nicht beweglichen Vakzine-resistenten Stämme ausbreiten und schwere Krankheitsausbrüche in Forellenfarmen verursachen können. Das Ziel dieses Projektes war, genotypische und phenotypische Unterschiede von Y. ruckeri Isolaten aus Nord-West Deutschland zu erfassen und zu analysiere. Es wurden unterschiedliches Koloniewachstum ermittelt, Intraspezies-Vergleiche in Hinblick auf in vitro Toxizität gegenüber verschiedenen Fischzelllinien, der Expression von Pathogenitätsfaktoren insbesondere zwischen beweglichen und unbeweglichen Isolaten angestellt und die Anfälligkeit von Isolaten gegenüber verschiedenen antimikrobiellen Substanzen sowie die genetischen Faktoren einer antimikrobiellen Resistenz untersucht. Ziel war es die Situation zu verstehen, mit der die Forellenzucht in Nord-West Deutschland jetzt konfrontiert ist.

Seit 2011 wurden 48 Y ruckeri Isolate von 12 Forellenteichwirtschaften in Nordrhein-Westfalen während verschiedener Jahreszeiten gesammelt. Zusätzliche 33 Isolate wurden vom LAVES Hannover und dem Fischgesundheitsdienst Hessen aus klinischen Ausbrüchen von ERM in Niedersachsen und Hessen zur Verfügung gestellt. Ein Referenzstamm wurde von der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover und ein typischer nicht beweglicher Stamm wurde von Dr. Gould vom MSD Animal Health bereitgestellt. Alle Isolate wurden durch biochemische Tests, Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) und Repetitive Sequenz-basierte PCR Analysen, inklusive (GTG)5-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR und REP-PCR, charakterisiert. Die Fettsäuremuster der Isolate wurden mittels Gaschromatographie analysiert. Die Cytotoxicität wurde an „Common carp brain“ (CCB), „Epithelioma papulosum cyprini (EPC), „fathead minnow“ Epithelzellen (FHM) und „Rainbow trout gonad-2“ (RTG-2) Zellinien bei verschiedenen Inkubationszeiten und Temperaturen untersucht. Eine Multiplex PCR wurde etabliert, um 10 verschiedene Virulenzfaktor-Gene (Hämolysingene yhlAB, Ruckerbactingene rucC and rupG, Gene des ABC Proteinexportersystems yrp1 and yrpDEF, Flagellare Secretionschaperon- Gene flgA, Gene des Flagellaren Sekretionsapparates flhA) von Y. ruckeri zu detektieren. Die Expression dieser Gene wurde mit einer semi-quantitativen PCR analysiert und verglichen. Empfindlichkeitstests gegenüber antimikrobiellen Substanzen und genetischen Eigenschaften für eine Resistenz gegenüber diesen Substanzen wurde mittels eines Mikrodillutionstest und einer PCR untersucht.

Aus den Isolaten konnten acht verschiedenen API 20E Profile erstellt werden, die sich vom Y. ruckeri Referenzstamm DSM 18506 unterschieden. Fünf Isolate wurden mittels 16s rDNA-Sequenzierung als Y. ruckeri bestätigt. 17 Isolate konnten Tween 80/20 hydrolisieren. Alle Y. ruckeri Isolate zeigten 15 wesentliche Fettsäuren, darunter 12:0, 13:0, 13.957 (Gleiche Kettenlänge, ECL unbekannt), 14:0, 14.502 (ECL unbekannt) 15:0 16:1ω5c, 16:0, 17:1ω8c, 17:0 CYCLO, 17:0, 16:1 2OH, 18:1ω9c, 18:1ω7c und 18:0. Zusätzlich zu 17 verschiedenen Mustern der PFGE wurden 2 verschiedene REP-PCR, 5 verschiedene ERIC-PCR, vier (GTG)5 –PCR und drei Muster in der BOX-PCR Analyse entdeckt. Entsprechend der Resultate aus API 20, PFGE und den verschiedenen PCR Analysen konnten die Isolate in 27 verschiedene Gruppen unterteilt werden. In den Regenbogenforellen der meisten untersuchten Fischfarmen wurden Isolate aus mehr als zwei verschiedenen Typisierungs Gruppen isoliert. Es stellte sich heraus, dass zwei der Isolat-Gruppen in allen drei Bundesländern Nord-West Deutschlands nachgewiesen werden konnten. Nicht bewegliche Stämme haben auf Fischzelllinien in den ersten 24 Stunden eine höhere in vitro Zytotoxizität als bewegliche Stämme, aber nach längerer Inkubationszeit bei niedrigen Temperaturen gibt es keine signifikanten Unterschiede mehr. Alle untersuchten Virulenz-Gene wurden sowohl in den beweglichen sowie auch in den beweglichen Y. ruckeri Stämmen gefunden. Weiterhin konnten in der Expression dieser Gene keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen werden. Für die meisten Antibiotika konnte eine unimodale Verteilung der MHK beobachtet werden. Im Allgemeinen stiegen die MHK mit der Inkubationszeit an. Für Enrofloxacin und Nalidixinsäure wurde eine bimodale Verteilung der MHK Werte festgestellt. Die eine Population zeigte MHK Werte von 0,008-0,015 mg/l bei Enrofloxacin und 0,25-0,5 mg/l bei Nalidixinsäure, während die andere Subpopulation MHK Werte von0,06-0,25 mg/l für Enrofloxacin und 8-64 mg/l für Nalidixinsäure zeigte. Während Isolate (n=3) aus der Subpopulation mit der niedrigeren MHK für (Fluor)chinolon eine nicht mutierte gyrA Wildtyp QRDR Gensequenz besaßen, zeigten (n=10) Isolate der Subpopulation mit der höheren MHK für (Fluor)chinolon eine Punktmutation eines Basenpaares in der gyrA Gensequenz. Dies resultiert in einer Änderung einer Aminosäure im GyrA Protein: Ser zu Arg oder Ser zu Ile (an Position 83) oder Asn zu Tyr (an Position 87) (Escherichia coli Nummerierung). Ein einzelnes Isolat zeigte hohe MHK für Sulfamethoxazol und Sulfamthoxazol/Trimethoprim. Ein etwa 8.9kb großes Plasmid wurde in diesem Isolat gefunden, dass die Gene sul2 strB und eine dfrA14 Genkasette die in das strA Gen integriert war aufwies. Weder Klasse 1 noch Klasse 2 Integrine konnten in diesen Isolaten gefunden werden.

Schlussfolgernd hieraus kann gesagt werden, das es eine Vielzahl von Y. ruckeri Stämmen in Nordwest Deutschland gibt, die zu einem Großteil aus nicht motilen Stämmen bestehen. In den meisten Farmen aus der Feldstudie waren zwei oder mehr verschiedene Y. ruckeri Isolate vorhanden. Im Winter war es einfacher für nicht bewegliche Stämme Krankheitsausbrüche hervorzurufen, da sie bei niedrigeren Temperaturen aktiver als die beweglichen Stämme waren. Die Fettsäure Zusammensetzung von Y. ruckeri Isolaten war homogen und es gab keine offensichtliche Verbindung zwischen den Fettsäuremustern und den epidemiologischen Parametern. Bewegliche Stämme von Y. ruckeri konnten in dieser Studie von nicht beweglichen Stämmen weder durch die Präsenz von Virulenzantigenen noch durch die Expression dieser Gene unterschieden werden. Die Inkubation von 24-28 Stunden bei 22+/-2°C scheint ausreichend zu sein, um die Empfindlichkeit von Y. ruckeri gegenüber antimikrobiellen Substanzen zu testen. Die große unimodale MHK Verteilung lässt vermuten, dass die meisten getesteten Isolate den Wildtyp repräsentieren, der keine Resistenzmechanismen erworben hat. Erwartungen waren (i) das Auffinden von Isolaten mit erhöhten MHK für (Fluor)chinolone die außerdem eine Resistenz vermittelnde Mutation in der QRDR Region des gyrA Gens, und (ii) Isolate, die Plasmidvermittelte sul2, dfrA14, ΔstrA und strB Gene tragen. Diese Untersuchungen bestätigten, dass Y. ruckeri fähig ist, Mutationen für eine Fluor)chinolon Resistenz zu entwickeln, aber ebenso Plasmid vermittelte Resistenzen zu erwerben.

abstract (englisch)

Yersinia ruckeri is the causative agent of Enteric Redmouth Disease, one of the most important infectious diseases in rainbow trout hatcheries in Europe. Although generally Y. ruckeri was well controlled by vaccination and antibiotic treatment, outbreaks of this disease were still periodically observed, especially in endemic areas. Moreover, some Y. ruckeri strains seem not to be affected by several of the commercial vaccines. All these strains were lacking motility, while strains from previous outbreaks were all motile. It was hypothesized that vaccination exerted a selective pressure that enabled the emergence of non-motile strains that are resistant to the commercial vaccines. Therefore, there is a high risk that these non-motile vaccine-resistant strains spread and originate severe outbreaks of disease in trout farms. The aim of this project was to investigate the genotypic and phenotypic diversity of Y. ruckeri isolates collected in North West Germany to figure out the relationship according to the colony development, compare intraspecies differences with in vitro cytotoxicity to different fish cell lines, and the expression of pathogenic factors, especially between motile and non-motile isolates, and study their susceptibility to different antimicrobial agents and the genetic determents of antimicrobial resistance to understand the situation trout farming in North Western Germany now is facing.

Since 2011, 48 Y. ruckeri isolates were collected from 12 trout farms in North-Rheine-Westphalia during different seasons. Additional 33 isolates, offered by LAVES Hannover and the fish disease service of Hessen, were from clinical cases in Lower Saxony and Hessen. One Reference strain was provided by the Clinic for Poultry at the University of Veterinary Medicine, Hannover, and one typical non-motile strain was offered by Dr. Gould from MSD Animal Health. The isolates were characterized by biochemical tests, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and repetitive sequence-based PCR assays, including (GTG)5-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR and REP-PCR. Whole cell fatty acid composition was analyzed by gas chromatography. Cytotoxicity assays were performed using Common carp brain (CCB), epithelioma papulosum cyprini (EPC), fathead minnow epithelial cell (FHM) and rainbow trout gonad-2 (RTG-2) cells at different incubation times and temperatures. A multiplex PCR was established to detect 10 virulence factor genes (hemolysin genes yhlAB, ruckerbactin genes rucC and rupG, ABC exporter protein system genes yrp1 and yrpDEF , flagellar secretion chaperones gene flgA, flagellar secretion apparatus gene flhA) found in Y. ruckeri. The expression of these genes was analyzed and compared by semi-quantitative PCR. Susceptibility tests to antimicrobial substances and genetic determents for a resistance to these substances were detected by microdilution test and PCR.

Eight different API 20E profiles were obtained, which were different from that of the Y. ruckeri reference strain DSM18506. Five isolates were confirmed as Y. ruckeri by 16S rDNA sequencing. 17 isolates hydrolyzed Tween 80/20. All Y. ruckeri isolates exhibited 15 major fatty acids, including 12:0, 13:0, 13.957 (equivalent chain length, ECL unknown), 14:0, 14.502 (ECL unknown), 15:0, 16:1ω5c, 16:0, 17:1ω8c, 17:0 CYCLO, 17:0, 16:1 2OH, 18:1ω9c, 18:1ω7c and 18:0. In addition to 17 PFGE patterns, two different REP-PCR patterns, five ERIC-PCR patterns, four (GTG)5-PCR patterns and three BOX-PCR patterns were obtained. According to the results of API 20E, PFGE and the various PCR assays, the isolates could be divided into 27 different groups. In rainbow trout hatcheries, isolates from more than two different typing groups were present in the same fish farm. Two groups of isolates were found to be present in all three federal states in North West Germany. Non-motile strains were more active to cause in vitro cytotoxicity to fish cell lines than motile strain in the first 24 h, but without significant difference after longer incubation at the lower temperature. All studied virulence genes were found present in both motile and non-motile strains of Y. ruckeri. In addition, no significant differences were found in the expression of these genes. For most of the antimicrobial agents tested, a unimodal distribution of MIC values was observed. In general, the MIC values increased with the incubation time. For enrofloxacin and nalidixic acid, a bimodal MIC distribution was observed with one population showing MICs of 0.008-0.015 mg/L of enrofloxacin and 0.25-0.5 mg/L of nalidixic acid, respectively, and the other subpopulation exhibiting MICs of 0.06-0.25 mg/L of enrofloxacin and 8-64 mg/L of nalidixic acid, respectively. While isolates (n=3) from the subpopulation with the lower (fluoro)quinolone MICs showed the non-mutated gyrA wildtype QRDR sequence, another ten isolates from the subpopulation with the higher (fluoro)quinolone MICs exhibited different single bp mutations that resulted in single amino acid substitutions in the GyrA protein: Ser ® Arg or Ser ® Ile (at position 83) or Asn ® Tyr (at position 87) [Escherichia coli numbering]. A single isolate showed high MIC values for sulfamethoxazole and sulfamethoxazole/trimethoprim. A ~8.9 kb plasmid was found in this isolate, which carried the genes sul2, strB and a dfrA14 gene cassette integrated into the strA gene. Neither class 1 nor class 2 integrons were found in this isolate.

In conclusion, there was a variety of Y. ruckeri isolates in North West German aquaculture, dominated by non-motile strain. In most farms from the field study, two or more different Y. ruckeri isolates were present. It was easier for non-motile strains to cause outbreaks in winter, since they were more active than motile strain at lower temperature. The fatty acid composition of Y. ruckeri isolates was homogenous and there was no obvious link between the fatty acid profiles and the epidemiological parameters. Non-motile strains of Y. ruckeri could not be differentiated from motile strains by either the presence of virulence genes detected in this study or by the expression of these genes. Incubation for 24h-28h at 22±2 °C appears to be sufficient for the testing of Y. ruckeri for susceptibility to antimicrobial substances. The largely unimodal MIC distribution suggests that most of the isolates tested represent the wildtype population that has not acquired resistance mechanisms. Exceptions were (i) the finding of isolates with elevated (fluoro)quinolone MICs that also had resistance-mediating mutations in the QRDR region of gyrA, and (ii) the single isolate that carried plasmid-borne sul2, dfrA14, ΔstrA and strB genes. This observation confirmed that Y. ruckeri is able to develop mutations for (fluoro)quinolone resistance, but can also acquire plasmid-borne resistance genes.

keywords

Genetischen Vielfalt, Antibiotikaresistanzen, Fettsäureprofil; genetic diversity, antimicrobial resistance, fatty acid profile,

kb

10.056