Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Abdullah Salah Kamel Hoter

Isolation and molecular characterization of one humped camel (Camelus dromedarius) heat shock proteins

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111297

title (ger.)

Isolierung und molekulare Charakterisierung von Hitzeschockproteinen des einhöckrigen Kamels (Camelus dromedarius)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hotera_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Isolierung und molekulare Charakterisierung von Hitzeschockproteinen des einhöckrigen Kamels (Camelus dromedarius)

Die Anpassung an thermischen Stress wurde als eine universelle physiologische Reaktion unter höheren eukaryotischen Arten angesehen. Bestimmte Tiere wie das arabische Kamel sind jedoch auf natürliche Weise so angepasst, dass sie in der Wüstenumgebung starken Hitzestress tolerieren. Diese Kreatur kann die rauen Temperaturen des Sommers ertragen und ist in der Lage, kalten Wintertemperaturen ohne physiologische Beeinträchtigung standzuhalten. Hitzeschockproteine sind Myriaden spezialisierter Moleküle, die als Schlüsselspieler in der zellulären Stressantwort, die von Hitzestress und anderen Stressfaktoren herrührt, fungieren. Tatsächlich enthalten eukaryotische Zellen zahlreiche HSP-Kandidaten, die in ihrer Struktur und Funktion variieren oder überlappen können. Während bisher der Hauptforschungsschwerpunkt auf der Analyse von HSP bei Haus- und Versuchstieren lag, wurde den Wüstentieren einschließlich des einhöckrigen arabischen Kamels wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Im Laufe des letzten Jahrzehnts wurde zunehmendes Interesse an der Klonierung von Hitzeschockproteinen aus Kameliden gezeigt, jedoch fehlt eine detaillierte zelluläre und molekulare Analyse dieser HSPs.

Das Hauptziel meiner Arbeit bestand in der Isolierung und Charakterisierung von drei repräsentativen Hitzeschockproteinen aus dem einhöckrigen Kamel (Camelus dromedarius) und deren Vergleich mit den humanen Homologen, um die effiziente physiologische Anpassung von Kameliden an Wüstenbedingungen auf molekularer und zellulärer Ebene zu untersuchen.

Das erste Kapitel meiner Doktorarbeit gibt eine Übersicht über die aktuelle Literatur, über die Entdeckung und Klassifizierung von Hitzeschockproteinen und über ihre allgemeinen Funktionen. Im Folgenden diskutiere ich ausführlich die verfügbaren aktuellen Informationen über die relevanten HSPs; ihre Struktur, Regulierung, Chaperon Rolle und ihre Funktion in Gesundheit sowie Erkrankung.

Das zweite Kapitel (Publikation I) beschreibt die erfolgreiche Klonierung der cDNAs, die für zwei cytoplasmatische Hitzeschockproteine (HSPs) von Camelus dromedarius kodieren (CRYAB und HSPA6), in einen Myc-markierten Säuger-Expressionsvektor und den Vergleichv it ihren Homologen im Menschen. Interessanterweise konnte ich mithilfe von COS-1-Zellen als Modell eines Säugetier-Expressionssystems Unterschiede in der Struktur und posttranslationale Modifikation der untersuchten HSPs von Kamelen und Menschen erkennen. Im Gegensatz zu CRYAB, das ähnliche Expressionsmuster und Modifikationen sowohl bei Kamel- als auch bei Menschen zeigte, zeigte das Kamel HSPA6 sowohl strukturelle als auch posttranslationale Modifikationsvariationen hinsichtlich der exprimierten Isoformen bzw. der O-Glycosylierung. Darüber hinaus wurden die exprimierten Isoformen der jeweiligen HSP sowohl in Kamel - als auch in Menschenspezies nach Exposition gegenüber Hitze und hypoxischen Stressfaktoren moduliert.

Im dritten Kapitel (Publikation II) wollte ich ein ganz besonderes HSP90-Mitglied charakterisieren, das sich im endoplasmatischen Retikulum (ER) befindet und als Glukose-reguliertes Protein 94 (GRP94) oder Endoplasmin sowohl von Kamel als auch von Menschen bekannt ist. Ich isolierte die cDNA von Kamel Endoplasmin unter Verwendung eines modifizierten (RACE) Ansatzes und klonierte die synthetisierte cDNA in einen FLAG-markierten Säugetier-Expressionsvektor. Interessanterweise war die abgeleitete Aminosäuresequenz der Kamel-Endopasmin-cDNA identisch mit der des menschlichen Homologen. Daher wurden die Charakterisierungsstudien einzig an dem vom Kamel stammenden Endoplasmin durchgeführt. Die Expressionsstudien von Kamelendoplasmin in COS-1-Zellen zeigten mehrere Isoformen des rekombinanten Kamelendoplasmins, analysiert mittels Western Blot. Darüber hinaus konnte ich freigesetzte Formen des rekombinanten Kamelendoplasmins nachweisen, die anscheinend eine andere posttranslationale Modifikation aufwiesen als die zellulären Endoplasminisoformen.

Zusammenfassend legt die vorliegende Arbeit nahe, dass Kamel CRYAB und GRP94 ähnliche strukturelle, posttranslationale und möglicherweise funktionelle Aspekte mit ihren humanen Homologen teilen. Mitglieder der HSP70-Familie; insbesondere HSPA6 sind in Bezug auf ihre O-Glycosylierung einzigartig. Basierend auf diesen Ergebnisse lässt sich vermuten, dass die O-Glykosylierung von HSP70-Mitgliedern in Wüstentieren als ein

potentieller Mechanismus wirkt, um den möglichen schädlichen Auswirkungen von Hitzestress auf die Proteinhomöostase und -stabilität entgegenzuwirken.

abstract (englisch)

Adaptation to thermal stress has been considered a universal physiological response among higher eukaryotic species. However, certain animals like Arabian camel are naturally adapted to tolerate severe levels of heat stress in the desert environment. This creature can withstand the harsh temperatures of summer and able to cope with cold winter temperatures without physiological impairment. Heat shock proteins (HSPs) are myriad specialized molecules that act as key players in the cellular stress response resulting from heat stress as well as other stresses. In fact, eukaryotic cells contain numerous HSP candidates which may vary or overlap in their structure and function. While the major research focus went to the analysis of HSPs in domestic and experimental animals, little attention has been paid to the desert animals including the one humped Arabian camel. Over the past decade, increasing interest has been demonstrated in cloning heat shock proteins from camelids, however, in-depth cellular and molecular analysis of these HSPs is still lacking.

The main objective of this thesis was to isolate and characterize three representative heat shock proteins from the one humped camel (Camelus dromedarius) and compare them to the human homologue in an attempt to understand the efficient physiological adaptation of camelids to desert conditions at the molecular and cellular level.

In the first chapter of my thesis, I wrote a literature background about the discovery and classification of heat shock proteins then briefly discussed their general functions. Next, I addressed in details the available up-to-date information about the HSPs in question; their structure, regulation, chaperone role and function in health and disease.

In the second chapter (Publication I), I successfully cloned the cDNA encoding two cytoplasmic heat shock proteins (HSPs); CRYAB and HSPA6 from Camelus dromedarius into a Myc-tagged mammalian expression vector and compared them to their homologues in human. Interestingly, using COS-1 cells as a model of mammalian expression system, I could detect variations in the structure and posttranslational modification of the analyzed camel and human HSPs. Unlike CRYAB which displayed similar expression pattern and modification in both camel and human species, the camel HSPA6 revealed both structural and posttranslational modification variations in terms of the expressed isoforms and O-glycosylation, respectively. In addition, the expressed isoforms of the respective HSP in both camel and human species were modulated after the exposure to heat and hypoxic stresses.

In the third chapter (Publication II), I aimed to characterize a very special HSP90 member that is located in the endoplasmic reticulum (ER) and known as glucose regulated protein 94 (GRP94) or endoplasmin from both camel and human. In this regard, I isolated the cDNA of camel endoplasmin using a modified (RACE) approach and cloned the synthesized cDNA into a FLAG-tagged mammalian expression vector. Remarkably, the deduced amino acid sequence of camel endoplasmin cDNA was identical to that of the human homologue. Therefore, it was agreed to proceed the characterization studies on the camel species alone. The expression studies of camel endoplasmin in COS-1 cells revealed multiple isoforms of the recombinant camel endoplasmin as analyzed by Western blot. In addition, I could detect released forms of the recombinant camel endoplasmin which appeared to have different posttranslational modification than the cellular endoplasmin isoforms.

The last part of the thesis discusses the results and findings in light of the current and previous related studies.

Taken together, the current thesis suggests that camel CRYAB and GRP94 share similar structural, posttranslational and possibly functional aspects with their human homologues. However, members of HSP70 family; particularly HSPA6 are unique in camels in respect of their O-glycosylation. In view of these results, O-glycosylation of HSP70 members in desert animals can be proposed to act as a potential mechanism for counteracting the potential deleterious effects of heat stress on protein homeostasis and stability.

keywords

Hitzeschockproteinen, einhöckrigen Kamels, Expression, HSPs, camel, expression

kb

7.605