Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Ina Holst

 

Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von iNOS, Mn-SOD und 3-NT bei Hunden mit Inflammatory Bowel Disease

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103098

title (engl.)

Immunohistochemical studies on the expression of iNOS, 3-NT, and Mn-SOD in dogs with inflammatory bowel disease

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/holsti_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Unter dem Begriff Inflammatory Bowel Disease (IBD) wird eine heterogene Gruppe von chronischen idiopathischen Darmentzündungen zusammengefasst, die durch persistierende oder intermittierende chronische gastrointestinale Symptome wie Diarrhö und/oder Erbrechen charakterisiert sind. Zur Diagnosestellung müssen klinische, labordiagnostische, sonographische, endoskopische und histologische Untersuchungsverfahren einbezogen werden. Die Ätiologie bzw. die Pathogenese der IBD ist nicht bzw. nur unvollständig geklärt.

Die induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) wird mittels verschiedener Zytokine sowie mikrobieller und bakterieller Produkte induziert und synthetisiert große Mengen an NO, welches zusammen mit Superoxid zur Bildung von Peroxynitrit und damit zu oxidativem Stress führen kann. Nitrotyrosin (3-NT) stellt einen Marker für oxidativen Stress dar. NO kann im Darm außerdem protektive und anti-inflammatorische Reaktionen auslösen. Die Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD) ist ein antioxidativ wirkendes Enzym, welches Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies bietet. In Untersuchungen an der Kolon-Lavage-Flüssigkeit von Hunden mit IBD wurden erhöhte Nitritkonzentrationen festgestellt, welche vermuten lassen, dass die entzündlichen Veränderungen im Darm mit einer erhöhten Aktivität von iNOS in der intestinalen Mukosa einhergehen.

In dieser Untersuchung wurden transmurale Biopsien des Magens, des Dünndarms (Duodenum, Jejunum, Ileum) und des Dickdarms von 14 darmgesunden Kontrollhunden und 15 Hunden mit IBD immunhistochemisch mit polyklonalen Antikörpern gegen iNOS, 3-NT und Mn-SOD untersucht. Die IBD Gruppe setzte sich aus zehn Hunden mit eosinophiler Kolitis (ausschließlich oder zusammen mit einer eosinophilen Gastritis oder Enteritis, EGE) und aus fünf Hunden mit lympho-plasmazellulärer Enteritis oder Enterokolitis (LPE) zusammen. Die Proben wurden qualitativ hinsichtlich des zellulären Expressionsmusters ausgewertet. Die Intensität der Expression wurde semiquantitativ erfaßt und einer statistischen Analyse unterzogen. Außerdem wurden die Kontrolltiere auf das Vorhandensein von altersassoziierten Unterschieden bezüglich der Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD untersucht.

Eine schwache iNOS-Expression war bei den Kontrollhunden in Enterozyten, mononukleären Immunzellen, Neuronen des autonomen Nervensystems und kleinen Gefäßwänden der intestinalen Mukosa darstellbar. In der Mukosa von entzündlich veränderten und nicht-entzündlich veränderten Proben der Hunde mit IBD fand sich ein ähnliches Expressionsmuster mit einer signifikant erhöhten Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD. Die Hauptquelle der iNOS-Expression stellte das intestinale Epithel dar. Die Proben der Hunde mit LPE oder EGE wiesen ein ähnliches Expressionsmuster auf. Die Expressionswerte zeigten keine Korrelation untereinander oder mit dem Grad der histologischen Veränderungen. Altersassoziierte Unterschiede waren nicht feststellbar.

Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die beiden untersuchten IBD-Formen mit einer deutlich erhöhten Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD einhergehen. Der Nachweis von 3-NT ist ein Anhaltspunkt dafür, dass toxisches Peroxynitrit in der Mukosa gebildet wird. Die verstärkte Expression von Mn-SOD weist auf ein vermehrtes Auftreten reaktiver Sauerstoffspezies hin. Aufgrund dieser Befunde ist davon auszugehen, dass NO bzw. Peroxynitrit und reaktive Sauerstoffspezies möglicherweise an der Entstehung und/oder Unterhaltung der entzündlichen Prozesse in der intestinalen Mukosa beteiligt sind.

Die schwache Expression von iNOS, 3-NT und Mn-SOD bei den Kontrolltieren wird möglicherweise durch eine kontinuierliche Stimulierung durch das normale intestinale, bakterielle Milieu hervorgerufen.

 

abstract (englisch)

The term inflammatory bowel disease (IBD) is used for a heterogenous group of chronic, idiopathic, inflammatory disorders of the bowel which are characterized by persistent or intermittent, chronic, gastrointestinal symptoms such as diarrhoea and/or vomiting. The diagnosis is based on clinical, laboratory, sonographical, endoscopical and histological examinations. The aetiology and the pathogenesis are incompletely clarified.

The induction of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) by certain cytokines, microbes and bacterial products leads to the production of large amounts of nitric oxide (NO), which results together with the superoxide anion in the production of peroxynitrite and oxidative stress. Nitrotyrosine (3-NT) is a marker of oxidative stress. NO is able to provoke protective and anti-inflammatory reactions in the intestine. Providing antioxidative functions manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) protects from reactive oxide species. Studies on colonic lavage fluid in canine cases of IBD revealed increased concentrations of nitrite suggesting that chronic inflammatory changes are associated with increased activity of iNOS in the intestinal mucosa.

In this study, transmural biopsies from the stomach, duodenum, jejunum, ileum and from the colon of 15 dogs with IBD and intestinal samples of 14 control dogs were examined immunohistochemically with polyclonal antibodies to iNOS, NT, and Mn-SOD. The IBD group was composed of 10 dogs with eosinophilic colitis (alone or together with eosinophilic gastritis or enteritis, EGE) and 5 dogs with lymphocytic-plasmacytic enteritis or enterocolitis (LPE). The sections were examined for the expression pattern and the intensity of the immunohistochemical expression was scored semiquantitatively. Statistical analysis was done. Another aim of the study was to investigate the age-dependent expression of iNOS, 3-NT and Mn-SOD in the gastrointestinal tract of healthy dogs.

Weak positive iNOS staining was detectable in enterocytes, mononuclear inflammatory cells, neurons in autonomic ganglia, and within the walls of small blood vessels in the intestinal mucosa. In the mucosa of inflamed and non-inflamed samples of IBD-affected dogs, a similar staining pattern was found, but of markedly higher intensity of iNOS, 3-NT and Mn-SOD. The intestinal epithelial cells displayed the major cellular source of iNOS expression. Samples of dogs with EGE and LPE exhibited a similar expression pattern. There was no correlation among the expression scores of the iNOS, 3-NT and Mn-SOD staining or with the degree of histological changes. Age-dependent changes were not detectable.

These findings demonstrate that eosinophilic enterocolitis and lymphocytic-plasmacytic enterocolitis in dogs is associated with markedly increased expression of iNOS, 3-NT and Mn-SOD. The detection of 3-NT suggests that also synthesis of peroxynitrite, a toxic derivative of NO, occurs. The increased expression of Mn-SOD indicates a reaction to an increased amount of reactive oxygen species. Because of the findings one may speculate that NO, respectively peroxynitrite and reactive oxygen species are involved in the development and/or maintenance of the inflammatory process in the intestinal mucosa of dogs with IBD. Weak expression of iNOS, 3-NT, and Mn-SOD of control dogs possibly results from continuous stimulation by the normal intestinal bacterial environment.

 

keywords

ROS, Hund, Immunhistochemie, IBD, iNOS, Mn-SOD

kb

10.733