Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Hang Thi Thu Hoang  

 

 

Analysis of host genetic factors influencing susceptibility to

influenza A infections using knockout mice

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108118

title (ger.)

Charakterisierung des Einflusses genetischer Wirtsfaktoren auf die Suszeptibilität des Wirtes gegenüber Influenza A Infektionen in Mausmutanten

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hoangt_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Das Influenza A Virus als Verursacher der echten Grippe gehört zu der Familie der Orthomyxoviridae und stellt eine globale Gefahr für die Gesundheit von Mensch und Tier dar, verbunden mit hohen jährlichen volkswirtschaftlichen Kosten. Sowohl fortlaufende genetische Veränderungen als auch die Möglichkeit zur Bildung neuer Subtypen durch Reassortation erschweren einen dauerhaften Schutz und medikamentöse Behandlung dieser Infektionskrankheit. Neben bekannten Risikofaktoren wie Virulenzfaktoren, Umwelteinflüsse und Gesundheitszustand spielt auch die genetische Prädisposition des Wirts für den Schweregrad des Verlaufs einer Influenzainfektion eine wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Doktorarbeit habe ich mit Hilfe eines Infektionsmodells an Mäusen einzelne genetische Faktoren untersucht, welche einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf ausüben können.

Die Aktivierung des Interferon Signalweges nimmt eine essentielle Rolle in der Immunantwort des Wirts auf eindringende Pathogene ein. Dieser Signalweg wird durch sogenannte Interferon regulierende Faktoren (IRFs) reguliert. Unter den neun bekannten Mitgliedern der IRF-Familie übernimmt Irf3 eine entscheidende Rolle für die Initiation der angeborenen Immunität gegen Bakterien und Viren. Da die Rolle für Irf3 im Hinblick auf Influenzaviren im lebenden Organismus noch weitgehend unbekannt ist, sollte in meiner Doktorarebit dieser Faktor durch die Verwendung eines Knockout-Mausmodells mit mutiertem Irf3-Gen näher charakterisiert werden. Nach Infektion mit PR8M (H1N1) Virus zeigten die Irf3-/- Mäuse eine erhöhte Suszeptibilität im Vergleich zu den Wildtypkontrollen, welche sich durch stärkere Gewichtsabnahme und erhöhte Sterblichkeit ausdrückte. In den Lungen infizierter Irf3-/- KO Mäuse konnte zu frühen Zeitpunkten eine signifikant erhöhte Viruslast nachgewiesen werden, was zu einer stärkeren Rekrutierung von Granulozyten im periphären Blut führte. Begleitend zu diesen Daten wurde eine verzögerte Expression einzelner Zytokine, Chemokine und Interferon-stimulierter Gene in Irf3-/- Mäusen auf RNA-Ebene gezeigt. Zusätzlich wurde diese Verzögerung der Typ I Interferon-Antwort auf Protein-Level bestätigt. Interessanterweise konnte in diesen Proben auch eine Erhöhung der Typ III Interferon-Antwort detektiert werden. Diese Daten lassen auf eine Funktion von Irf3 während der Initiation der Immunantwort auf eine Influenza A Infektion über den Interferon-Signalweg schließen. Zudem scheint es möglich, dass die Abwesenheit dieses Faktors möglicherweise zu Kompensationsmechanismen durch alternative Aktivierungsmöglichkeiten führt.

Im zweiten Teil meiner Arbeit wurde mit dem Interferon regulierendem Gen Irf7 ein weiterer Faktor des Interferon Signalweges im Kontext von Influenza A Infektionen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust des Irf7 Gens in Mäusen zu einer verstärkten Dissemination bestimmter Influenza A Subtypen in verschiedene Organe führt. Ein erheblicher Anstieg viraler RNA in Milz und Gehirn von SC35M (H7N7) infizierten Tieren konnte über eine quantifizierende RT-PCR nachgewiesen werden. Dieser Unterschied wurde in PR8M (H1N1) und maHK68 (H3N2) infizierten Organen nicht detektiert.

Zuletzt wurde von mir die Fähigkeit der TMPRSS11D Protease zur proteolytischen Aktivierung des viralen Hämagglutinins im lebenden Organismus näher untersucht. Der Knockout in diesem Gen führte zu verminderter Viruslast von maHK68 (H3N2) Viren in Lungen und verzögerter Virusvermehrung in Tracheen nach Infektion im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen. Zudem etablierte ich ein ex vivo Tracheen-Infektionsmodell, mit welchem eine signifikant verminderte Vermehrung von H3N2 Viren in KO-Tracheen gezeigt wurde. Diese Daten lassen auf eine Rolle der TMPRSS11D Protease bei der proteolytischen Aktivierung von Hämagglutinin schließen.

Zusammengefasst zeigte ich in dieser Doktorarbeit, dass die Interferon regulierenden Gene Irf3 und Irf7 einen wichtigen Beitrag zur Wirtsantwort gegenüber Influenza A liefern. Es werden zukünftig weitere Studien notwendig sein, um die komplexen und redundanten Mechanismen des Interfon-Signalweges und dessen Auswirkung auf Wirt und Pathogen besser zu verstehen. Darüber hinaus konnte ich die Beteiligung der Wirtsprotease TMPRSS11D für die Replikation des Influenza A Virus zeigen.

 

abstract (englisch)

Influenza A virus, which belongs to the Orthomyxoviridae family, is of global concern regarding human and animal health and has a great impact on worldwide economics. The high genetic variance of influenza A virus in addition to its capability to re-assort makes it very difficult to fight influenza disease in humans and animals. However, severity of influenza disease is not only caused by virulence factors of the influenza A virus itself but also depends on host factors. In my PhD thesis work, I used the mouse infection model to study host genetic factors that might contribute to the severity of disease after influenza A infection.

Activation of the interferon pathway is essential for the host defense. The pathway is regulated by so-called interferon regulatory factors (IRFs). Among the nine members of the IRF family, IRF3 plays a crucial role in the initiation of the innate immunity against bacteria and viruses. Therefore, in my thesis work, I studied the host response to influenza A infection in a knockout (KO) mouse line that carried a mutation in the interferon regulatory factor 3 (Irf3) gene which resulted in a non-functional gene product. After infection with PR8M (H1N1) virus, C57BL/6J-Irf3-/- mice revealed a more susceptible phenotype compared to wild type (WT) C57BL/6J controls. Irf3-/- KO mice showed increased body weight loss and mortality compared to WT mice after infection with H1N1 virus. Concomitantly, hematological analysis showed a significantly higher ratio of granulocytes to lymphocytes (Gr/Lym) in Irf3-/- KO mice indicating that mutant mice were able to mount an innate immune response. However, a delay in the expression of certain cytokines, chemokines and interferon stimulated genes in Irf3-/- mice was observed in lung transcriptome analysis at day 3 post infection (p.i.). In addition, a delayed interferon type I response was seen at the protein level in broncho-alveolar lavage (BAL). Interestingly, interferon type III was expressed at a higher level in Irf3-/- KO compared to WT at day 2 p.i.. These results suggest that Irf3 is necessary for regulating the immediate early host defense. However, in the absence of Irf3, alternative interferon activating pathways are up-regulated in KO mice which in part compensate for the absence of Irf3 and allow some mice to survive the infection.

In the second part of my thesis, I analyzed another interferon regulatory gene, the interferon regulatory factor 7 (Irf7), with respect to the host defense against influenza A virus infections. After infection with PR8M (H1N1), maHK68 (H3N2) and SC35M (H7N7), guts, spleens and brains of C57BL/6J-Irf7-/- (KO) and C57BL/6J-Irf7+/+ (WT) mice were investigated for the presence of viral RNA. An obvious presence of viral RNA was detected in spleens and brains of SC35M-infected mice compared to other samples. Furthermore, in these samples, a significantly higher amount of viral RNA was detected in Irf7-/- mice compared to WT controls indicating an enhanced dissemination of SC35M in mice in the absence of  Irf7.

In the third part of my thesis work, I studied the mouse protease TMPRSS11D which has been described in vitro to cleave viral hemmaglutinin (HA). Reduced viral titers in lungs and a delayed replication of maHK68 (H3N2) in trachea of Tmprss11d-/- (KO) mice were observed when comparing to FVB/NRj (WT) controls early after infection. Furthermore, in my thesis work, I established an ex vivo model and showed significantly lower number of virus particles in tracheas of Tmprss11d-/- at day 2 p.i. compared to tracheas from WT mice. These results suggest that TMPRSS11D is required for activation and replication of H3N2 in the respiratory tract of infected hosts.

In conclusion, by using different mutant mouse lines, I showed that Irf3 and Irf7 genes are important contributors to the host response against influenza A virus. Further studies to elucidate the underlying mechanisms in more detail will be needed in the future to understand the complex and redundant system of the interferon pathways and the impact on virus and host biology. Furthermore, I demonstrated that the host protease TMPRSS11D is involved in HA cleavage. To understand the role and impact of this protease in combination with other proteases, future studies are required.

 

keywords

Influenza A Virus, Wirtsantwort, Interferon regulierende Faktor / Influenza A virus, host response, interferon regulatory factor

kb

2.956