Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Lena-Maria Hillermann

Neue Strategien zur Verbesserung von Streptococcus-suis-Ganzzellvakzinen: die Neutralisation der IgM-Proteolyse und der inverse Opsonophagozytosetest

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106506

title (engl.)

New strategies to improve Streptococcus-suis-bacterins: the inverse opsonophagocytosis assay and the neutralization of the IgM proteolysis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hillermannl_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Streptococcus suis verursacht Meningitis, Septikämie, Arthritis und andere Erkrankungen im Schwein und ist weltweit verantwortlich für große Verluste in der Schweinehaltung. Bis jetzt sind 35 verschiedene Serotypen beschrieben worden, von denen in Europa Serotyp 2 und 9 am häufigsten mit Ausbrüchen assoziiert sind. Alle untersuchten Serotypen bilden eine hoch spezifische Immunglobulin M spaltende Protease (IdeSsuis).

Da es in Europa keinen zugelassenen Impfstoff gibt, werden bei Bestandsproblemen häufig stallspezifische Vakzine eingesetzt. In früheren Studien wurde gezeigt, dass Immunisierungen mit Serotyp 2 und, in geringerem Maße, mit Serotyp 9 opsonisierende Antikörper hervorrufen. Die Titer opsonisierender Antikörper korrelieren mit der Protektion der Vakzine. Die Ziele dieser Arbeit waren i) die Etablierung eines Testes zur Evaluierung des Herstellungsprozesses, besonders der Inaktivierung einer Ganzzellvakzine ii) die Bestimmung der protektiven Wirksamkeit einer rIdeSsuis-Immunisierung und iii) die Bestimmung der Immunogenität von rIdeSsuis.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden unterschiedliche Kultivierungs- und Inaktivierungsbedingungen der Bakterien sowie verschiedene Lagerungszeiten einer Ganzzellvakzine verglichen. Für diesen Vergleich konnte ein neuer Test, der inverse Oposonophagozytosetest (iOPA), etabliert werden. Der Test beruht auf der Hypothese, dass die Eigenschaft des Antigens einer Ganzzellvakzine, opsonisierende Antikörper aus einem Hyperimmunserum zu binden, mit dem Vermögen der Ganzzellvakzine, opsonisierende Antikörper und Protektion hervorzurufen korreliert. Im iOPA erfolgte die Absorption opsonisierender Antikörper aus Referenzseren mit unterschiedlich kultivierten oder inaktivierten Bakterien bzw. gelagerten Ganzzellvakzinen. Die Referenzseren wurden durch Immunisierungen von SPF-Schweinen mit Serotyp 2, 7 oder 9 Ganzzellvakzinen generiert. Im iOPA wurden die Titer opsonisierender Antikörper im Referenzserum vor und nach Absorption mit den Bakterien bzw. der Ganzzellvakzine bestimmt. Die Serotyp-2-Kulturen absorbierten opsonisierende Antikörper besser als vergleichbare Serotyp-9-Kulturen und dies am besten in der stationären Wachstumsphase. Für die Absorption opsonisierender Antikörper durch inaktivierte Bakterien konnte eine signifikante Abhängigkeit von der eingesetzten Formaldehydkonzentration, insbesondere für Serotyp 9, aufgezeigt werden. Unterschiedliche Auswirkungen einer Formaldehyd- und Wasserstoffperoxid-Inaktivierung wurden im iOPA nicht festgestellt. Während der Lagerung über einen Zeitraum von 6 Monaten war ein Verlust der Absorptionsfähigkeit des Antigens einer Ganzzellvakzine nicht nachweisbar. Die Ergebnisse des iOPA legen insgesamt nahe, dass die Inaktivierung der Streptokokken ein besonders kritischer Schritt bei der Herstellung einer Vakzine ist.

 

Ganzzellvakzinen induzieren nach einmaliger Applikation einen Anstieg von IgM-Antikörpern, aber keine protektive Wirkung. Die IgM-Protease von S. suis, IdeSsuis, könnte wesentlich an dieser ausbleibenden Schutzwirkung beteiligt sein. Im Verlauf dieser Arbeit wurde daher die Arbeitshypothese untersucht, dass die Neutralisation der IgM-Protease und die Grundimmunisierung mit der Ganzzellvakzine eine synergistische Wirkung entfalten könnte. Die Neutralisation der IgM-Protease konnte durch die Immunisierung mit rIdeSsuis hervorgerufen werden. In einem Immunisierungsversuch mit Läuferschweinen erfolgte ein Vergleich einer rIdeSsuis-Immunisierungsgruppe, einer Kombinationsgruppe (rIdeSsuis und Grundimmunisierung Ganzzellvakzine), einer Ganzzellvakzinegruppe (Grundimmunisierung Ganzzellvakzine) und einer Placebogruppe. Interessanterweise führte die rIdeSsuis-Immunisierung sowohl alleine als auch in Kombination mit der Ganzzellvakzine zu einer vollständigen Protektion vor Mortalität und hoher Morbidität nach einer S.-suis-Serotyp-2-Infektion. Die Immunität war mit dem effizienten Abtöten vom S.-suis-Wildtyp im porzinen Blut ex vivo assoziiert. Im Opsonophagozytosetest mit neutrophilen Granulozyten und den Seren der immunisierten Schweine konnte der bakterizide Effekt nicht reproduziert werden. In rekonstituiertem Blut, bestehend aus den zellulären Bestandteilen von ungeimpften Tieren und dem αIdeSsuis-Serum wurde der S.-suis-Wildtyp aber abgetötet. Daher scheinen mehr zelluläre Bestandteile als nur neutrophile Granulozyten an dem Antikörper-vermittelten Abtöten der Bakterien beteiligt gewesen zu sein. Alle Tiere dieser Studie hatten nachweisbare Titer an αS.-suis-IgM-Antikörpern. Das Abtöten von S. suis im Blut der immunisierten Versuchstiere könnte daher durch αS.-suis-IgM-Antikörper vermittelt worden sein, welche nach Neutralisation der IdeSsuis-vermittelten Proteolyse die Bakterienoberfläche opsonisieren konnten. Für dieses Modell spricht, dass mit der Absorption der Seren rIdeSsuis-immunisierter Schweine an die ideSsuis-Mutante die bakterizide Wirkung im rekonstituierten Blut eliminiert werden konnte.

In dieser Arbeit wurde mit einem neuen Test, dem iOPA, die Bedeutung der Inaktivierungsbedingungen bei der Herstellung einer Ganzzellvakzine aufgezeigt. Weiterhin konnte ein protektives Antigen identifiziert und die entsprechende immunogene Wirkung ermittelt werden. In zukünftigen Studien sollte die Quantifizierung der Absorptionsfähigkeit im iOPA mit der in vivo hervorgerufenen protektiven Wirkung der Ganzzellvakzinen verglichen werden. Für die zukünftige Entwicklung eines rekombinanten IdeSsuis-Impfstoffes ist wichtig abzuklären, ob dieser auch gegen weitere Serotypen schützt. Zum besseren Verständnis der protektiven Wirkung von rIdeSsuis sollten Untersuchungen zur Identifikation und funktionellen Charakterisierung der beteiligten Blutzellen im Vollblutversuch durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind sowohl für die Verbesserung von stallspezifischen Impfstoffen als auch für die langfristige Entwicklung eines zugelassenen rekombinanten S.-suis-Impfstoffes von besonderem Interesse.

abstract (englisch)

Streptococcus suis causes meningitis, septicemia, arthritis and other diseases in pigs and is worldwide responsible for major economic losses in the pig industry. Thirty five serotypes have been described, in Europe serotypes 2 and 9 are most frequently associated with disease outbreaks. All investigated serotypes express a highly specific immunoglobulin M protease (IdeSsuis).

As no licensed vaccine is available in Europe, autologous bacterins are commonly used for prophylaxis. In previous studies it was demonstrated that bacterins of serotype 2 and to a lesser extent also of serotype 9 elicit opsonizing antibodies. Importantly, titers of opsonizing antibodies were found to correlate with protection. The objectives of this study were i) to establish a test for evaluation of bacterin production, especially inactivation of bacteria and to determine ii) the protective efficacy as well as iii) the immunogenicity of rIdeSsuis.

In the first part of this study different culture and inactivation conditions as well as different times of storage were comparatively evaluated. For this, a new test was established, designated the inverse opsonophagocytosis assay (iOPA). This test is based on the hypothesis that binding of opsonizing antibodies in a reference hyperimmune serum to a bacterin correlates with the capacity of the bacterin to elicit opsonizing antibodies and protection. In the iOPA the absorption of opsonizing antibodies was conducted with differently cultured or inactivated bacteria as well as with bacterins stored for different time periods. Reference hyperimmune sera were generated through vaccination of SPF piglets with serotype 2, 7 or 9 bacterins. Titers of opsonizing antibodies were determined in the reference sera before and after absorption with the bacteria or the bacterin in the inverse opsonophagocytosis assay (iOPA). Interestingly, serotype 2 bacteria absorbed opsonizing antibodies to a greater extent than respective serotype 9 cultures and to a greater extent in the stationary phase than during exponential growth. Absorption of opsonizing antibodies with inactivated bacteria was demonstrated to significantly depend on the formaldehyde concentration used for inactivation of bacteria, especially in the case of serotype 9. Inactivation with formaldehyde or hydrogen peroxide did not result in detectable differences in the iOPA. A reduced capacity to absorb antibodies was not recorded during a bacterin storage for 6 months. The results of the iOPA suggest that inactivation is a critical step in bacterin generation, because important epitopes might be lost.

 

Bacterin priming elicits IgM antibody titers but no protection. The IgM-protease of S. suis, designated IdeSsuis, might be responsible, at least in part, for this lack of protection. This work investigated the hypothesis that bacterin priming and neutralization of the IgM-protease exhibits a synergistic effect. Vaccination with rIdeSsuis elicited antibodies neutralizing the IgM protease activity. An animal experiment with growing piglets was conducted to compare an rIdeSsuis immunization group, a combination group (rIdeSsuis immunization and bacterin priming), a bacterin group (priming only) and a placebo group. Interestingly, vaccination with rIdeSsuis alone or in combination with bacterin priming resulted in a very high degree of protection against morbidity and mortality caused by S. suis serotype 2 challenge. The protective immunity elicited by rIdeSsuis immunization was associated with efficient killing of S. suis wt in porcine blood ex vivo. The bactericidal effect was not reproducible in the opsonophagocytosis assay including porcine neutrophils and serum of rIdeSsuis -vaccinated piglets. The reconstituted blood consisting of blood cells from unvaccinated piglets and anti-rIdeSsuis hyperimmunserum was also sufficient to kill S. suis wt. These results indicated that other cells but neutrophils participate in the antibody-mediated killing of S. suis elicited by rIdeSsuis vaccination. Noteworthy, all piglets included in this study had detectable titers of specific IgM against S. suis prior challenge. Thus, neutralization of IdeSsuis might have paved the way for an IgM-mediated killing of S. suis in the blood of vaccinated piglets. This model is supported by the fact that the bactericidal effect in reconstituted blood was eliminated after absorption of sera of rIdeSsuis-vaccinated piglets with the 10ΔideSsuis mutant.

Concluding, in this work the importance of inactivation conditions during bacterin generation was demonstrated in a new test, the iOPA. Furthermore a protective antigen was identified and its immunogenicity was determined. Future studies should compare quantification of the absorption factor in the iOPA with the capacity of a bacterin to elicit protection. For the development of a recombinant IdeSsuis vaccine it is important to find out if the vaccine protects also against other serotypes. For a better understanding of the protective efficacy of rIdeSsuis experiments should be designed to identify and functionally characterize the blood cells involved in killing of S. suis in the blood of rIdeSsuis vaccinated pigs ex vivo. The results of this work are important for improvement of autologous bacterins as well as for the future development of a licensed rIdeSsuis vaccine.

keywords

IgM Protease, Streptococcus suis, Schwein, IgM protease, Streptococcus suis, pig

kb

1.552