Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Lea Katharina Heuer

ZNS-Schädigung durch Toxocara spp. -

in vivo- und in vitro-Untersuchungen zur Demyelinisierung und Zytotoxizität

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107286

title (engl.)

CNS damage by Toxocara spp. - in vivo and in vitro investigations on demyelination and cytotoxicity

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/heuerl_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Neuroinvasive Larven des Hunde- und Katzenspulwurms Toxocara canis bzw. T. cati können beim Menschen schwere zentralnervöse Störungen auslösen. Eine solche Beteiligung des zentralen Nervensystems (ZNS) im Rahmen einer Toxocara spp.-Infektion wird als Neurotoxokarose bezeichnet. Im Mausmodell wurden hierbei Degenerationen der weißen Substanz, sogenannte Demyelinisierungen, beobachtet. Doch trotz dieser gravierenden Schadwirkung der Parasiten, ihrer weltweiten Prävalenz sowie ihrer Assoziation mit Epilepsie, neurodegenerativen und neuropsychiatrischen Erkrankungen, gibt es nur wenige neuropathologische oder molekulare Untersuchungen zur Neurotoxokarose. Die vorhandenen Studien beschränken sich darüber hinaus auf T. canis als Krankheitserreger. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die molekulare Untersuchung der mit T. canis- und T. cati-induzierter Neurotoxokarose verbundenen Demyelinisierung. Ein weiteres Ziel war die Beleuchtung des pathogenetischen Hintergrundes dieser Demyelinisierungen. Hierbei könnten durch wandernde Gewebslarven hervorgerufene mechanische Schäden, Immunreaktionen oder direkte zytotoxische Effekte eine Rolle spielen. Da Daten zu Parasit-Zell-Interaktionen und Toxocara-vermittelter Zytotoxizität nur begrenzt verfügbar sind, wurde ein Ko-Kultursystem von lebenden Toxocara-Larven und murinen neuronalen (CAD), oligodendrozytären (BO-1) und mikroglialen (BV-2) Zelllinien sowie Hirngewebekulturen etabliert, um sich diesen Fragestellungen in vitro zu nähern. Zur molekularen Untersuchung der Demyelinisierung wurden die Transkriptionsraten von acht Myelin-assoziierten Genen (Cnp, Mag, Mbp, Mog, Mrf-1, Nogo-A, Plp1, Olig2) in der chronischen Phase der Infektion an sechs Zeitpunkten bei C57Bl/6J (B6)-Mäusen mittels quantitativer real-time PCR analysiert. Die Expression ausgewählter Myelinproteine wurde mittels Immunoblots oder Immunohistochemie untersucht. Darüber hinaus wurden Parenchymschädigungen, insbesondere Demyelinisierungsprozesse, histologisch beurteilt. Bei jedem der untersuchten Gene konnten signifikante Unterschiede zwischen den Transkriptionsraten T. canis-infizierter und nicht infizierter Kontrollmäuse festgestellt werden. Im Gegensatz dazu beeinflusste T. cati lediglich fünf von acht untersuchten Genen. Einige Veränderungen des Transkriptionsmusters entsprachen den Erwartungen, wie etwa die Abregulierung von Mbp in Groß- und Kleinhirnen T. canis-infizierter Mäuse an Tag 120 post infectionem (pi), an dem histologisch ausgedehnte Demyelinisierungen nachweisbar waren. Andere Veränderungen, wie die Aufregulierung von Cnp und Mog bei sowohl T. canis- als auch T. cati-infizierten Mäusen im Vorwege der Demyelinisierung sind offenbar Ausdruck anderer Prozesse als der De- oder Remyelinisierung. Daher scheinen direkte traumatische und hypoxische Effekte der Larvenwanderung sowie sekundäre Vorgänge, insbesondere Immunreaktionen des Wirtes, in den ermittelten Transkriptionsmustern ebenso Ausdruck zu finden wie Demyelinisierungen und Prozesse der Remyelinisierung geschädigter Bereiche. In den Ko-Kulturexperimenten wurde das zytotoxische Potential der Larven für die ZNS-Zellen bzw. Brain Slices sowohl mikroskopisch als auch enzymatisch untersucht. Dabei erwies sich die mikroskopische Beurteilung mittels Trypanblaufärbung als weniger verlässlich und sensitiv als der Laktat-Dehydrogenase (LDH)-Test. Interessanterweise beeinträchtigten lebende Toxocara-Larven die Vitalität von oligodendrozytären bzw. mikroglialen Zellen in den Zellkulturen sowie Brain Slices nicht. Vermutlich ist die in vivo-Pathologie daher eher Folge traumatischer oder immunvermittelter Vorgänge als das Ergebnis eines direkten zytotoxischen Effekts. Im Gegensatz dazu verminderten jedoch bereits niedrige Zahlen von T. canis- und T. cati-Larven das Überleben differenzierter CAD-Zellen, die morphologisch primären Neuronen gleichen. Dies unterstreicht das pathogene Potential beider Toxocara-Spezies und wirft neue Fragen bezüglich der Bedeutung dieser Ergebnisse im in vivo-Kontext, insbesondere im Hinblick auf T. cati, auf. Da T. canis und nicht T. cati allgemein als Hauptauslöser der Neurotoxokarose betrachtet wird, sollte angesichts der erhobenen Daten die pathogenetische Bedeutung von T. cati-Larven sowie die Konsequenzen ihrer fortgesetzten Präsenz im menschlichen Gehirn nicht unterschätzt werden.

abstract (englisch)

Neuroinvasive larvae of the common dog and cat roundworms, Toxocara canis and T. cati, may cause serious central nervous disturbances in humans. Such CNS involvement in the course of infection with Toxocara spp. has been termed neurotoxocarosis. In mouse models of neurotoxocarosis, degeneration of white brain matter, i. e. demyelination, has frequently been described. Despite these severe findings, worldwide prevalence of these parasites and their association with epilepsy, neurodegenerative and neuropsychiatric diseases, neuropathological and molecular investigations on neurotoxocarosis are scarce and focus predominantly on T. canis. Therefore, one objective of this study was the molecular characterisation of nerve fibre demyelination associated with T. canis- and T. cati-induced neurotoxocarosis. Additionally, this study aimed to elucidate the pathogenetic background of Toxocara-induced demyelination, which might be due to mechanical damage, immune reactions or direct cytotoxic effects of migrating larvae. As data on parasite-cell interaction and Toxocara-mediated cytotoxicity is limited, a novel co-culture system of vital Toxocara-larvae and murine neuronal (CAD), oligodendrocytal (BO-1) and microglial (BV-2) cell lines as well as brain tissue slices was established to address these questions in vitro. For molecular investigation on demyelination, transcription of eight myelin-associated genes (Cnp, Mag, Mbp, Mog, Mrf-1, Nogo-A, Plp1, Olig2) was analysed during six time points of the chronic phase of infection in C57Bl/6J (B6) mice using quantitative real-time PCR. Immunoblotting or immunohistochemistry were employed to determine expression of selected myelin proteins. Additionally, parenchymal damage, e.g. demyelination, was monitored histologically. Significant differences between transcription rates of T. canis-infected and uninfected control mice were detected for all analysed genes while T. cati affected five of eight investigated genes. Some transcriptional changes coincided with expectations, such as the down-regulation of Mbp in cerebra and cerebella of T. canis-infected mice on day 120 post infection (pi), when extensive demyelination was histologically evident. Other changes like up-regulation of Cnp and Mog in both T. canis- and T. cati-infected mice prior to the onset of demyelination, appear to reflect other processes than de- and remyelination alone. Therefore, the recorded myelin transcription patterns might reflect direct traumatic and hypoxic effects of larval migration as well as secondary processes including host immune reactions alongside demyelination and attempts to remyelinate damaged areas. In co-culture experiments, enzymatic and microscopic methods were carried out to analyse potential cytotoxic effects of larval presence on CNS-cells or brain slices. Microscopic evaluation using trypan blue exclusion assay revealed to be less reliable and sensitive than the lactate dehydrogenase (LDH) activity assay. Interestingly, vital Toxocara larvae did not impair the viability of oligodendrocytal and microglial cells in cell cultures as well as brain slices. Conclusively, trauma or immune-mediated mechanisms induced by migrating larvae might cause in vivo pathology rather than acute cytotoxic effects. In contrast, even low numbers of both T. canis and T. cati larvae impaired survival in the primary neuron-like, differentiated CAD cells. This highlights their destructive potential and raises new questions regarding the significance of this finding in an in vivo context, particularly concerning T. cati. As T. canis and not T. cati is considered the major cause of human neurotoxocarosis, these findings shed a different light on the pathogenic potential of T. cati-larvae and the consequences of their prolonged presence in the human brain.

keywords

Parasitäre Zoonose, larva migrans, Demyelinisierung, Parasitic zoonosis, larva migrans, demyelination

kb

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