Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Martina Hesse

Characterization of the binding properties of the

Avian Coronavirus spike protein

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106498

title (ger.)

Charakterisierung der Bindungseigenschaften des Spike Proteins des Aviären Coronavirus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hessem_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Das aviäre Coronavirus (AvCoV) Infektiöses Bronchitis-Virus ist ein Erreger, der den Respirations- und den Urogenitaltrakt von Vögeln, hauptsächlich vom Huhn (gallus gallus) und anderen Galliformen, befällt. Für alle Viren ist die Bindung an Wirtszellen der erste und ein wichtiger Schritt im Replikationszyklus. Für die Bindungsfähigkeit der Coronaviren ist die S1-Untereinheit des Spike-Proteins verantwortlich. Im Fall von IBV hängt die Bindung an Wirtszellen von der Präsenz von Sialinsäuren auf der Zelloberfläche ab.

In der vorliegenden Studie wurden chimäre lösliche S1-Untereinheiten, versehen mit einem humanen IgG-Fc-Marker-Peptid, hergestellt und als Werkzeuge zur detaillierteren Untersuchung der Bindungseigenschaften der S1-Domäne von IBV, benutzt. Diese chimären Proteine können in permanenten Zelllinien exprimiert, durch Zentrifugation ankonzentriert und mithilfe Fluoreszenz-markierter anti-human-IgG-Antikörper leicht nachgewiesen werden. Aus den vielen verschiedenen IBV-Stämmen wurde für diese Untersuchungen der B1648-Stamm für die Erzeugung der löslichen Proteine ausgewählt. Dabei handelt es sich um einen Feldstamm, der in Belgien isoliert wurde. Dieser Stamm weist keine zusätzliche, durch Passage in nichtaviären Zellen gewonnene, Bindungseigenschaft auf, wie beispielsweise der Beaudette-Stamm. Außerdem verhält sich dieser Stamm in vivo pathogen. In dieser Arbeit haben wir uns zwei Fragen bezüglich der Bindungseigenschaften des IBV Spike-Proteins gewidmet. Einerseits wurde untersucht, wo auf dem Spike-Protein die rezeptorbindende Domäne lokalisiert ist. Andererseits wurde analysiert, ob das IBV Spike-Protein weitere Bindungseigenschaften, außer der Fähigkeit an Zucker zu binden, besitzt.

Zur Lokalisationsbestimmung der zuckerbindenden Domäne wurden einige Aminosäuren in der Sequenz der S1-Untereinheit deletiert, um so festzustellen, ob durch diese Deletionen die Bindungsfähigkeit des Proteins herabgesetzt wird. Dabei konnte die Bedeutung von 42 Aminosäuren, die nahe am N-Terminus des Proteins lokalisiert sind, für die Bindung gezeigt werden. In einem zweiten Schritt wurde dieser Bereich auf sieben besonders wichtige Aminosäuren eingegrenzt. Die dabei verbleibende Restbindung, die bei allen Mutanten auftrat, war nicht abhängig von Sialinsäuren.

Um zu untersuchen, ob ein Proteinrezeptor an der Bindung von IBV beteiligt ist, wurden die löslichen Spike-Proteine zur Ermittlung von Interaktionen mit Zelloberflächenproteinen eingesetzt. Protease-Behandlung von IBV-empfänglichen Zellen wurde angewandt, um generell eine Beteiligung von Zelloberflächenproteinen bei der Virusbindung zu untersuchen. Der erste Ansatz führte nicht zur Identifizierung spezifischer Interaktionspartner. Der zweite Ansatz konnte zeigen, dass die Bindung der Spike-Proteine an proteasebehandelte Zellen nicht herabgesetzt war, was gegen die Beteiligung eines spezifischen Proteinrezeptors spricht.

Schließlich wurde auch die Fähigkeit der löslichen Proteine, an permanente Zelllinien zu binden, untersucht. Da das Bindungsvermögen der Spike-Proteine als ein Hauptfaktor für die Festlegung des Wirtsspektrums angesehen wird, überraschte es, dass die Konstrukte in der Lage waren, an Zellen zu binden, die in unseren Experimenten kaum durch das korrespondierende Virus B1648 infiziert werden konnten.

abstract (englisch)

The avian coronavirus (AvCoV) infectious bronchitis virus (IBV) is a pathogen affecting the respiratory and the genito-urinary tract of birds, mainly of chickens (gallus gallus) and other galliforme birds. For all viruses the attachment to host cells is the first and an important step in the viral life cycle. The binding ability of coronaviruses resides in the S1-subunit of their spike protein and in the case of IBV host cell binding has been demonstrated to be dependent on the presence of sialic acids on the cellular surface.

In the present study chimeric soluble S1-subunits of the IBV spike protein connected to human IgG-Fc-tags are prepared and used as tools to analyze the binding properties of the S1-domain of IBV in more detail. These chimeric proteins are expressed in continuous cell lines, concentrated by centrifugation through filter columns and can easily be detected with fluorescence labeled anti-human IgG-antibodies. Out of the huge variety of different IBV strains, the spike protein of the B1648 strain, a field isolate from Belgium, was chosen for this study. It has not acquired additional binding affinities by passages in non-avian cells like the Beaudette strain and it is pathogenic in vivo. In this work, two questions were addressed regarding the IBV spike binding characteristics. First, it was examined where the sialic acid binding site is located within the S1 subunit of the spike protein. Second, it was analyzed, if the IBV spike protein harbors any binding properties apart from sugar binding.

For localization of the sugar binding domain, stretches of amino acids in the sequence of the S1 domain were deleted to see if the binding ability is impaired by these changes. The importance of 42 amino acids located near the N-terminus of the molecule for binding was demonstrated. In a second step, this range was narrowed down to seven amino acids. The residual binding, that all deletion mutants exhibited, was not sialic acid-dependent.

To analyze if a protein receptor is involved in the IBV attachment, the soluble spike proteins were used to search for interacting cellular surface proteins and protease treatment of cells was applied to analyze the role of proteins in viral binding. The former approach did not result in the identification of specific interactions. The latter revealed that spike protein binding to protease-treated cells was not reduced, arguing against the involvement of a specific protein receptor in host cell binding of IBV.

Moreover, the ability of the soluble spike protein to bind to continuous cell lines was tested. Since spike protein binding is viewed as a main factor determining the host range, it was unexpected to see that the construct was able to bind to cells, which were hardly susceptible to infection by the corresponding IB virus strain B1648.

keywords

Avian Coronavirus. Spike protein, host cell attachment, Aviäres Coronavirus, Spike Protein, Wirtszellenbindung 

kb

12.289