Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Thomas Henniger

 

Bovine neonatale Panzytopenie – Auswirkungen auf Nierenfunktionsparameter und Zusammenspiel mit der Infektion mit Anaplasma phagocytophilum

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103913

title (engl.)

Bovine neonatal pancytopenia – effects on renal function parameters and interaction with the infection with Anaplasma phagocytophilum

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hennigert_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Die bovine neonatale Panzytopenie (BNP), die seit dem Jahr 2006 vor allem in Europa auftritt, ist eine impfinduzierte, alloimmunbedingte Erkrankung junger Kälber, die mit einer Leukopenie und Thrombozytopenie sowie einer massiven Depletion der hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark einhergeht. Auffällig werden betroffene Kälber vor allem durch zum Teil spektakuläre hämorrhagische Diathesen, die sehr oft tödlich enden. Bald nach den ersten gehäuften Meldungen dieses hämorrhagischen Syndroms wiesen epidemiologische Studien einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von BNP und der Impfung der Kälbermütter mit einer inaktivierten Vakzine gegen das bovine Virusdiarrhoe-Virus (BVDV) nach. Man fand heraus, dass nur Kälber, welche das Kolostrum von Kühen erhielten, die mit dem Impfstoff PregSure®BVD (Firma Pfizer GmbH) geimpft wurden, BNP entwickelten.

Mithilfe der Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz gelang der Nachweis alloreaktiver kolostraler Antikörper, welche Oberflächenantigene auf Thrombozyten und Leukozyten der Kälber erkennen. Bei der Suche nach den Zielantigenen dieser Alloantikörper konnte MHC I identifiziert werden, was in engen Zusammenhang mit der bovinen Nierenzellkultur gebracht wurde, auf denen das Impfvirus gezüchtet wurde, sodass die Immunisierung gegen MHC I im Impfling auf eine Kontamination des Impfstoffes mit Zellkulturbestandteilen zurückzuführen war. Eine monokausale, MHC I basierte Alloreaktivität kann jedoch nicht erklären, warum unter anderem BNP-assoziierte Endothelschäden fehlen, da sich auf dessen Zellen ebenso MHC I Moleküle befinden, noch können subklinische Formen der BNP erklärt werden, bei denen Hämorrhagien fehlen.

Die Pathogenese von BNP scheint komplexer zu sein, als durch das MHC I-Modell beschrieben, denn es deutet vieles darauf hin, dass kolostrale Antikörper von BNP-Müttern eine Vielzahl an Zielantigenen erkennen. Jedoch konnte noch nicht geklärt werden, welche dieser Antigene tatsächlich an der Pathogenese beteiligt sind und welche Mechanismen dahinterstecken.

Die Auswirkungen einer überstandenen BNP im Organismus genesener Kälber wurde bislang nicht erforscht. Aufgrund der durch die alloreaktiven Antikörper hervorgerufenen Zerstörung von Blutzellen und der daraus resultierenden hämorrhagischen Diathese ergab sich die Vermutung, dass Kälber, die eine BNP überleben, durch anfallenden Zelldetritus, Hämoglobinablagerungen und eine anämische Hypoperfusion renale Schäden davontragen könnten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, diese Frage anhand von Nierenfunktionsanalysen an vier Wochen alten Kälbern, die eine BNP überlebt hatten, zu klären. Die Kälber wurden im Rahmen eines Versuches zur Reproduktion der BNP mit Kolostrum getränkt, welches von PregSure®BVD-geimpften Kühen stammte, die schon mindestens ein Kalb mit verifizierter klinischer BNP hatten. Die untersuchten Kälber zeigten im Alter von wenigen Tagen bis zu drei Wochen eindeutige hämatologische und klinische Anzeichen von BNP, überlebten jedoch und waren zur Zeit der Untersuchungen klinisch gesund.

Um Schädigungen der Tubulusepithelzellen zu verifizieren, wurde die Aktivität der γ-Glutamyltransferase (GGT) im Harn ermittelt. Die Nierenfunktion wurde anhand von fraktionellen Exkretionen (FE) der Elektrolyte Natrium, Kalium, Calcium sowie von Phosphat und Wasser evaluiert. Die FE wurden auf der Basis der Analysen einer simultan gewonnenen Harn- und Blutprobe mit nasschemischen Methoden bestimmt und auf der Grundlage der endogenen Creatinin-Exkretion berechnet.

Zwischen gesunden Kälbern und Kälbern, die eine BNP überlebt hatten, konnten keine Unterschiede in den Nierenfunktionsparametern festgestellt werden. Auf der Basis der ermittelten Werte aller 38 Kälber wurden Referenzwerte für die o. g. fraktionellen Exkretionen sowie für die Aktivität der γ-Glutamyltransferase (GGT) im Harn in Bezug zur Konzentration von Creatinin im Harn als Maß für die Schädigung von Tubulusepithelzellen ermittelt.

Es wurde gezeigt, dass alters- und fütterungsspezifische Referenzwerte für Nierenfunktionswerte bei Rindern notwendig sind. Bei Nierenfunktionsanalysen bei Kälbern muss die alimentäre Elektrolytversorgung beachtet werden, um die alimentär bedingte Beeinflussung der Elektrolytexkretion von Nierenfunktionsstörungen unterscheiden zu können. Auf der Basis der erarbeiteten Referenzwerte für Milchkälber können Nierenfunktionsstörungen sensitiv ermittelt und evtl. weiter differenziert werden.

Bei dem im Jahr 2011 durchgeführten Versuch zur Reproduktion von BNP wurde anhand von hämatologischen Untersuchungen ein Kalb mit einer präkolostralen Infektion mit Anaplasma (A.) phagocytophilum identifiziert. Da die bovine Anaplasmose bisher ausschließlich als eine durch Zecken übertragbare Erkrankung galt, stellt diese Diagnose eine derzeit einzigartige in Deutschland dar, da bis dato keine Berichte über eine intrauterine Infektion mit A. phagocytophilum unter Feldbedingungen vorlagen. Verglichen mit anderen Kälbern, die während des Versuches an BNP erkrankten und starben, waren sowohl die klinischen Symptome als auch die hämatologischen Befunde signifikant deutlicher ausgeprägt, sodass von einem additiven Effekt der beiden Erkrankungen ausgegangen wird.

Durch molekulargenetische Analysen des ankA-Gens und des 16S rRNA-Gens wurde herausgefunden, dass im Blut des Kalbes zwei Varianten von A. phagocytophilum enthalten waren, von denen jedoch nur eine im Blut der Mutter identifiziert werden konnte. Eine mögliche Begründung dieses Befundes besteht darin, dass die Mutter initial zwei Stämme übertragen hatte, die anhand ihres ankA Gens nicht voneinander unterschieden werden konnten, und bei der Geburt des Kalbes einen Stamm bereits wieder eliminiert hatte. Es könnte auch sein, dass einer der Stämme aufgrund einer niedrigen Bakterienanzahl unter die Detektionsgrenze gesunken war. Eine weitere Möglichkeit ist die Rekombination innerhalb der Spezies, die zu zwei verschiedenen ankA Genvarianten im Blut des Kalbes geführt haben könnte.

 

abstract (englisch)

Bovine neonatal pancytopenia (BNP) has mainly emerged in Europe since the year 2006 and is a vaccine-induced, alloimmune-mediated disease of young calves, characterized by leukopenia, thrombocytopenia and a severe depletion of all haematopoietical precursor cells in the bone marrow. Affected calves are first noted due to partly massive haemorrhagic diatheses which often end lethal. Soon after the first reports about this haemorrhagic syndrome, an association between the occurrence of BNP and the vaccination of the dams of the affected calves with an inactivated vaccine against the bovine viral diarrheal virus (BVDV) was found out by epidemiological studies. Investigations revealed that only calves which were fed with the colostrum from dams vaccinated with PregSure®BVD (Pfizer GmbH, Germany) were affected with BNP.

By the means of flow cytometry and immunofluorescence colostral alloreactive antibodies were detected which have a binding affinity to cell surface antigens of thrombocytes and leukocytes from the calves. Searching for the target antigens, MHC class I could be identified, which has been associated with the bovine kidney cell line on which the vaccine virus had been cultivated. Therefore, a contamination of the vaccine by debris from the cell culture has been stated to be the reason for the immunization against MHC class I. Nevertheless, a monocausal alloreactivity based on antibodies against MHC class I cannot explain the lack of BNP-induced endothelial damage, because on endothelial cells there are also molecules of MHC class I. Subclinical forms of BNP without haemorrhages could not be explained by this way, neither.

The pathogenesis of BNP seems to be more complex than the MHC class I model can explain, because there are strong signs that colostral alloantibodies of BNP-dams recognize a large variation of antigens. However, these antigens and the pathomechanisms of BNP could not have been identified by now.

The effects of an infection with BNP on the organism of recovered calves have not been investigated yet. It has been suggested that calves that survived BNP would suffer from permanent renal damage due to the alloreactive-induced destruction of blood cells followed by haemorrhagic diatheses, accumulation of haemoglobin and cell debris with consequent anaemical hypoperfusion of the kidneys. One objective of this work was to clear this question by the means of renal function tests in calves of four weeks of age which survived BNP. The calves were fed with colostrum from PregSure®BVD-vaccinated dams which had lost at least one calf after parturition due to BNP in previous lactations. At the age of few days to three weeks the calves showed distinct clinical and haematological signs of BNP, however, they survived and were clinically healthy when examination happened.

To verify renal tubular damage, the activity of the urinary γ-glutamyltransferase (GGT) has been measured. Based on the fractional excretions (FE) of sodium (Na), potassium (K), calcium (Ca), phosphate (P) and water, the renal function was evaluated. The fractional excretions were determined by means of wet chemical analyses of simultaneously taken urine and blood samples. Their calculation was based on the endogenous excretion of creatinine. There were no significant differences in the FE between calves with and without a BNP-history. Based on the values of all 38 calves, reference values were calculated for the fractional excretions mentioned above, and also for the urinary γ-glutamyltransferase / creatinine ratio as a parameter for the damage of tubular cells.

It has been demonstrated that age- and feeding-specific reference values for renal function parameters in cattle are necessary. For renal function analyses in calves, the nutritional supply with electrolytes has to be considered in order to differentiate the variability of electrolyte excretions due to different feeding regimes from renal disorders. Based on the calculated reference values for calves fed milk replacer, renal function disorders can be determined sensitively and further differentiation is possible.

By the means of haematological analyses a calf with a precolostral infection with Anaplasma (A.) phagocytophilum could be identified in the course of the study about the reproducibility of BNP in the year 2011. Since bovine anaplasmosis has been known as an exclusively tick-borne disease by now, this diagnosis is unique in Germany, because by now, there are no reports about an intrauterine infection with A. phagocytophilum under field conditions. Compared to the other calves that suffered and died from BNP in this study, the clinical as well as the haematological symptoms were significantly more distinct, which means an additive effect of both diseases.

By the means of molecular genetical analyses of the ankA gene and the 16S rRNA gene it could be demonstrated that the calf's blood harboured two variants of A. phagocytophilum, of which only one could be identified in the blood of its dam. The possibility exists that the dam initially transmitted two strains that were not distinguishable apart from their ankA genes and that she had already cleared one of them at time of delivery. It might also be that the bacterial burden of one of the strains had already fallen below the detection limit. Alternatively, intra-species recombination could have taken place leading to the appearance of two ankA gene variants in the calf's blood.

keywords

Nierenfumktion, Anaplasmose, hämorrhagische Diathese, renal function, anaplasmosis, haemorrhagic diathesis

kb

255