Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Silvia Hennecke

Molekulargenetische Untersuchungen caniner Mammatumoren und ihrer zirkulierenden Nukleinsäuren

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107274

title (engl.)

Molecular Analysis of canine mammary tumors and their circulating nuleic acids

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/henneckes_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Mammatumore sind die häufigsten Neoplasien beim weiblichen Hund. Im Rahmen dieser Dissertation sollten chromosomale Aberrationen sowohl im Tumorgenom als auch in den zirkulierenden Nukleinsäuren an Mammatumoren erkrankter Hunde nachgewiesen und miteinander verglichen werden. In der ersten Publikation (Beck J., Hennecke S., et al.: Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA. PLoS ONE. 2013; 8(9): e75485) wurde die DNA von fünf malignen Tumoren, die zugehörige Leukozyten-DNA und ihre zirkulierenden Nukleinsäuren isoliert und mit Hochdurchsatz-Sequenzierung untersucht.

Die Sequenzierungsdaten der Tumoren zeigten ein sehr heterogenes Muster der genomischen Aberrationen. Zwei Tumore zeigten chromosomale Aneuploidien und ein Tumor zeigte kleinere Deletionen. In einem weiteren Tumor konnten interchromosomale Fusionen nachgewiesen werden, wohingegen ein Tumor keine der genannten Aberrationen aufwies.

In den zirkulierenden Nukleinsäuren konnten diese unterschiedlichen Aberrationen der Tumor-DNA mittels Sequenzierung ebenfalls detektiert werden. Die Abweichungen zum Tumor sind jedoch deutlich geringer, da es zu einer Verdünnung der Nukleinsäuren der apoptotischen Tumorzellen durch normale Körperzellen im Blut kommt. Für vier der Tumoren wurde ein tumor- und aberrationsspezifisches digitales PCR-Assay entwickelt, womit der tumorspezifische Anteil in den zirkulierenden Nukleinsäuren nachgewiesen wurde. Zwischen den Tieren variierte dieser Anteil sowohl zwischen den Tumoren als auch den zirkulierenden Nukleinsäuren grundlegend. Bei einem Tier konnte die tumorspezifische Nukleinsäure noch 83 und 89 Wochen nach der Mastektomie detektiert werden. Daraufhin wurde mit Hilfe einer Computertomographie eine Lungenmetastase bei diesem Tier nachgewiesen.

In vier von fünf Tumoren konnte durch Sequenzierung eine Deletion am proximalen Ende des Chromosoms 27 detektiert werden, wohingegen der überwiegende Anteil der Aberrationen nur in zwei Tumoren auftrat. In diesem Bereich des Chromosoms 27 liegt das Prefoldin-Untereinheit 5-Gen (PFDN5). Das kodierte Protein ist Teil des Prefoldin-Komplexes und beim Menschen ist insbesondere PFDN5 dafür bekannt, den c-Myc Transkriptionsfaktor zu unterdrücken. Dadurch besitzt es das Potential, als Tumor-suppressorgen zu fungieren und kann aufgrund dessen mit hoher Wahrscheinlichkeit als Kandidatengen angesehen werden. Die oben beschriebene Deletion wurde mittels Droplet Digitaler PCR in 10 von 20 malignen Mammatumoren bestätigt. Innerhalb dieser Gruppe wurde bei Tumoren mit der Deletion ein signifikant erhöhter Ki-67 Wert ermittelt. Darauf aufbauend wurde in der zweiten Publikation (Hennecke S., et al.: Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in canine mammary tumors. PLoS ONE. 2015; 10(7):e0131280. doi:101371) die PFDN5 Deletion an einer größeren Probandenanzahl untersucht. Es wurden 102 maligne und 40 benigne Mammatumoren und 11 Mammageweben ohne histopathologischen Befund auf des Auftreten der Deletion getestet.

Die PFDN5 Deletion wurde in 24% der malignen, aber nur in 9% der benignen Mammatumore detektiert. In den nicht-malignen Geweben war sie nicht nachweisbar. Innerhalb der malignen Tumore trat die Deletion in den verschiedenen Untergruppen unterschiedlich häufig auf. Zusätzlich zur Deletion konnten bei den malignen Mammatumoren erhöhte Ki-67 Werte als Zeichen einer erhöhten Proliferationsrate festgestellt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei den untersuchten malignen Mammatumoren strukturelle Genomaberrationen nachgewiesen wurden, so dass deren Korrelat im Plasma als Tumorbiomarker anwendbar erscheint. Dies gilt besonders für das Auftreten der Deletion des PFDN5 Gens, das einen potentiellen neuen Tumormarker auf molekulargenetischer Ebene darstellen könnte.

abstract (englisch)

Mammary tumors represent the most frequent cancers in female dogs. As part of this thesis the chromosomal aberrations in the tumor genome and in the cell-free DNA from dogs with mammary tumors were detected and compared with each other. For the first publication (Beck J., Hennecke S., et al.: Genome aberrations in canine mammary carcinomas and their detection in cell-free plasma DNA. PLoS ONE. 2013; 8(9): e75485) the DNA of five malignant tumors, the corresponding white blood cell DNA and their cell-free DNA were extracted and massive parallel sequencing was performed.

The sequencing data of the tumors revealed heterogeneous patterns of genomic aberrations. Chromosomal aneuploidies were found in two tumors and frequent smaller deletions were found in one tumor. Another tumor showed interchromosomal fusions, whereas one tumor was devoid of any of these anomalies.

After sequencing these different aberrations of tumor DNA were also detected in cell-free DNA. However, the deviations are much lower compared to the tumor, because the cell-free DNA from apoptotic tumorcells was diluted by cell-free DNA from normal cells. A tumor- and aberration-specific digital PCR assay was designed for four of these tumors, to detect the tumor-specific part of the cell-free DNA. Amongst the dogs the content of tumor-specific rearrangements differed between the tumors and the cell-free DNA. In one of the animals the tumor-specific cell-free DNA was detected 83 and 89 weeks after mastectomy, a subsequent tomographic examination of the animal revealed a metastatic lesion in the lung.

In summary in malignant mammary tumors structural aberrations were detected and their correlation in cell-free DNA in the plasma supports the use as a cancer biomarker.

In four out of five tumors the sequencing revealed a deletion of the proximal end of canine chromosome 27, whereas the majority of the aberrations occurred in one or two tumors. The proximal part of canine chromosome 27 harbors the prefoldin subunit 5 gene (PFDN5) encoding a protein that is a part of the so-called prefoldin complex. In particular PFDN5 in humans is known to repress the c-MYC transcription factor. Thus it is a potential candidate tumor suppressor gene. By using droplet digital PCR deletion of the PFDN5 was confirmed in 10 out of 20 malignant tumors. In these tumors the Ki-67 scores were significantly higher in the presence of the deletion. Based on these findings in the second publication (Hennecke S., et al.: Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in canine mammary tumors. PLoS ONE. 2015; 10(7):e0131280. doi:101371) the PFDN5 deletion were validated in 102 malignant and 40 benign canine mammary tumors and in 11 mammary tissues without histopathological findings.

The PFDN5 deletion was detected in 24% of the malignant and only in 9% of the benign tumors and was not detectable in normal mammary tissue. The occurrence of the deletion differed in the subgroups of the malignant tumors. Thus presence of the PFDN5 gene deletion in malignant mammary tumor was confirmed and potentially represents a new tumor biomarker.

In tumors with the deletion the higher Ki-67 scores were confirmed as well. The association of a higher Ki-67 score and PFDN5 deletion is indicative for an increased proliferation rate, therefore a relation to tumor aggressiveness can be assumed.

In conclusion in the investigated malignant mammary tumors structural genomic aberrations were detected, so that their correlate in the plasma appears applicable as a tumor biomarker. This is especially true for the occurrence of the PFDN5 deletion and it represent a potential new tumor marker on the molecular genetic level.

keywords

Mammatumore, zirkulierende Nukleinsäure; Mammary tumors, circulating nucleid acids

kb

9.136