Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Julia Heinrich

Untersuchungen zum Aufbau und zur Dynamik der Blut-Hoden-Schranke in Mäusen mit einem Sertoli Zell-spezifischen Knockout von Connexin43 (SCCx43KO

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109814

title (eng.)

Investigations on the composition and dynamics of the blood-testis barrier in mice with a Sertoli cell specific knockout of connexin43 (SCCx43KO)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/heinrichj_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Connexin43 (Cx43) ist das dominierende Gap Junction (GJ) Protein im Hoden und es verbindet im Keimepithel sowohl benachbarte Sertoli Zellen (SZ) als auch SZ und Keimzellen (KZ). In Fällen von gestörter Spermatogenese konnte beim Mann sowie bei verschiedenen Tierarten eine veränderte Cx43-Expression festgestellt werden. Neben anderen Funktionen, spielt Cx43 auch eine Rolle im Aufbau und der Dynamik der Blut-Hoden-Schranke (BHS). Neben GJ sind auch Adherens Junctions (AJ) und Tight Junctions (TJ) am Aufbau der BHS beteiligt. Die BHS bildet sich während der Pubertät im unteren Drittel des Keimepithels, wodurch dieses in ein basales und ein adluminales Kompartiment unterteilt wird. Im basalen Kompartiment liegen die diploiden KZ-Populationen (Spermatogonien und primäre Spermatozyten) und im adluminalen Kompartiment liegen die weiter entwickelten haploiden KZ (sekundäre Spermatozyten, runde und elongierte Spermatiden). Die Aufgaben der BHS sind es, die haploiden KZ-Populationen vor der Erkennung durch das körpereigene Immunsystem zu schützen und durch kontrollierten Stoffaustauch ein spezifisches Mikromilieu für die Entwicklung der KZ bereitzustellen. Die BHS ist allerdings kein starres, sondern ein sehr dynamisches Gebilde, denn die KZ müssen im Laufe ihrer Entwicklung die BHS passieren, ohne dass diese ihre Integrität einbüßt. Neben anderen TJ-Proteinen, wie Occludin und Mitgliedern der JAM-Familie, sind die Claudine ein wichtiger Bestandteil der BHS. Während Claudin-11 in den SZ der Maus stadienunabhängig exprimiert wird, zeigen die Claudine 3 und -5 die höchste Expression in den Stadien des Keimepithelzyklus, in denen die präleptotänen/leptotänen Spermatozyten die BHS überqueren. Zudem werden diese beiden TJ-Proteine im Keimepithel nicht nur von den SZ, sondern auch von einigen KZ-Populationen exprimiert (Claudin-3: präleptotäne/leptotäne Spermatozyten; Claudin-5: Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden). Claudin-3 und -5 können daher mit der Dynamik der BHS in Verbindung gebracht werden. Um den Einfluss von Cx43 auf den Aufbau und die Dynamik der BHS zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit das etablierte transgene SZ-spezifische Cx43 Knockout Mausmodell verwendet (SCCx43KO). Die homozygoten männlichen Nachkommen (SCCx43KO-/-) zeigen eine gestörte Spermatogenese, was möglicherweise auf eine gestörte Dynamik der BHS zurückgeführt werden kann.

 

Daher hat sich der erste Teil der vorliegenden Arbeit mit der vergleichenden Untersuchung der Expressionsmuster der TJ-Proteine Claudin-3, -5 und -11 in adulten SCCx43KO-/-- und Wildtyp (WT)-Mäusen beschäftigt. Hierfür wurden immunhistochemische Färbungen sowie Real-Time PCR (qRT PCR) Versuche durchgeführt. Besonders interessant hierbei war die Betrachtung der Tubuli mit Restspermatogenese in den SCCx43KO-/--Tieren. Diese Tubuli machen ca. 5 % der Keimtubuli dieser Tiere aus und es konnte bisher weder eine fehlerhafte Deletion des Cx43-Gens noch eine Kompensation durch andere Connexine festgestellt werden, welche die Restspermatogenese erklären könnten. In den Keimtubuli ohne Restspermatogenese konnte für Claudin-11 immunhistochemisch eine scheinbar höhere Proteinsynthese sowie ein diffuses Verteilungsmuster im SZ-Zytoplasma nachgewiesen werden. Auf mRNA-Ebene zeigte sich eine 2,07-fach höhere Expression in den SCCx43KO-/--Tieren im Vergleich zu den WT-Tieren. Diese Erhöhung war allerdings statistisch nicht signifikant. Claudin-3 und -5 konnten in den Keimtubuli ohne Restspermatogenese immunhistochemisch gar nicht nachgewiesen werden. Für Claudin-3 ergab sich auf mRNA-Ebene eine statistisch signifikante fast 64-fache Erniedrigung; für Claudin-5 ergab sich nur eine 1,42-fache Erniedrigung, welche nicht statistisch signifikant war. In den Keimtubuli mit Restspermatogenese zeigte Claudin-11 erstmals in Tubuli mit runden Spermatiden eine feinere Färbung und eine Verlagerung der immunopositiven Reaktion in Richtung BHS. Claudin-5 zeigte erstmals in Tubuli mit Spermatozyten eine deutlich immunopositive Reaktion um diese Zellen. Claudin-3 zeigte in den Tubuli mit Restspermatogenese ein sehr inhomogenes Färbemuster. Ab einem Arrest der Spermatogenese auf Höhe der Spermatozyten zeigten sich mal eine positive und mal gar keine Reaktion im basalen Bereich des Keimepithels. In den Tubuli mit einer qualitativ normalen Spermatogenese zeigten alle drei Claudine das gleiche Färbemuster wie in adulten WT-Tieren. Während eine intakte BHS für die SCCx43KO-/--Mäuse bereits nachgewiesen werden konnte, geben die Veränderungen der Expression von Claudin-3 und -5 Hinweise auf eine gestörte Dynamik der BHS. Claudin-11 scheint trotz der diffusen Verteilung im Zytoplasma der SZ in der Lage zu sein, funktionsfähige TJ im Bereich der BHS auszubilden. Die Beobachtungen aus den Tubuli mit der Restspermatogenese lassen auf eine Regulation der TJ Proteine durch die KZ schließen.

 

Der zweite Teil der Arbeit hat sich mit der Entwicklung der BHS in peripubertären SCCx43KO-/--Tieren beschäftigt. Hierfür wurden immunhistochemische Färbungen und qRT-PCR Versuche für das TJ-Protein Claudin-11 in verschiedenen Altersstufen in SCCx43KO-/-- und WT-Mäusen, sowie funktionelle Untersuchungen zur Integrität der BHS durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die SCCx43KO-/--Mäuse während der Pubertät, im gleichen Zeitraum wie die WT-Tiere, eine intakte BHS ausbilden. Während Claudin-11 bei den WT-Tieren ab Tag 12 p. p. eine basale Lokalisation der Immunreaktion zeigte, zeigte sich bei den SCCx43KO-/--Tieren über den gesamten Zeitverlauf der Untersuchung (Tag 2–23 p. p.) eine diffuse Verteilung im SZ Zytoplasma. Auf mRNA-Ebene ergaben sich keine signifikanten Unterschiede der Expression zwischen den beiden Genotypen für die Lebenstage 2–14. Allerdings zeigte sich an Tag 14 ein leichter Trend zu einer höheren Claudin-11-mRNA-Expression in den SCCx43KO-/--Tieren. Die Ergebnisse der funktionellen Untersuchung gaben zusätzlich erste Hinweise darauf, dass die Ausbildung der BHS in den SCCx43KO-/--Tieren gegenüber den WT Tieren beschleunigt abläuft.

 

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige Hinweise darauf geben, dass ein Verlust von Cx43 in den SZ zu einer gestörten Dynamik der BHS führt. Ob die gestörte Dynamik die Ursache oder die Folge der gestörten Spermatogenese ist, bleibt offen. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass die SCCx43KO-/--Tiere während der Pubertät, im gleichen Zeitraum wie die WT-Tiere, eine intakte BHS ausbilden, dies scheint sogar beschleunigt abzulaufen.

abstract (englisch)

Connexin43 (Cx43) is the predominant testicular gap junction (GJ) protein. Within the seminiferous epithelium, it connects adjacent Sertoli cells (SC) as well as SC and germ cells (GC). In cases of impaired spermatogenesis, Cx43 expression has been shown to be altered in men and several animal species. Amongst other functions, Cx43 is supposed to play a role in blood-testis barrier (BTB) formation and dynamics. Additionally, other junctional proteins, like adherens junctions (AJ) and tight junctions (TJ), are involved in the establishment of this barrier. The BTB is built up during puberty in the basal third of the seminiferous epithelium and it divides this epithelium into a basal and an adluminal compartment. The basal compartment contains diploid GC (spermatogonia and primary spermatocytes), whereas the adluminal compartment contains more advanced haploid GC (secondary spermatocytes, round and elongated spermatids). The BTB is crucial for GC survival and for normal progression of spermatogenesis as this barrier protects haploid GC from the innate immune system. Moreover, it enables a controlled exchange of substances creating a specific environment for the GC-development. However, the BTB is not rigid, but it is a very dynamic structure as developing GC must cross the BTB to reach the adluminal compartment without compromising the integrity of the BTB. Amongst other TJ-proteins, like occludin and members of the JAM-family, claudins are important components of this barrier. While claudin-11 is expressed in SC during all stages of the seminiferous epithelium in the mouse, claudin-3 and -5 show highest expression levels in those stages, when preleptotene/leptotene spermatocytes cross the BTB and therefore can be associated with BTB dynamics. In contrast to claudin-11 these claudins are not only expressed in SC but also in specific GC (claudin-3: preleptotene/leptotene spermatocytes; claudin-5: spermatogonia, spermatocytes and spermatids). To examine the relevance of Cx43 on the function of the BTB, the established transgenic SC specific Cx43 knockout mouse model (SCCx43KO) was used in this study. Homozygous male SCCx43KO mice (SCCx43KO-/-) show spermatogenic disorders that might be caused by an altered BTB assembly and/or disassembly, composition or regulation.

 

Therefore, in the first part of the study, the expression pattern of the TJ proteins claudin-3, -5 and -11 was investigated in adult SCCx43KO-/- mice and compared to wild type (WT) mice. For this purpose, immunohistochemical stainings as well as quantitative real time PCR (qRT-PCR) were performed. In this context, investigation of tubules with residual spermatogenesis in the SCCx43KO-/- mice was particularly interesting. These tubules account for around 5% and up to now neither a deficient deletion of the Cx43 gene nor compensation by another connexin could be identified, explaining the residual spermatogenesis. In tubules without residual spermatogenesis an apparently higher protein expression as well as a diffuse distribution pattern for claudin-11 could be demonstrated compared to WT mice. Accordingly, a 2.07-fold increase in mRNA expression could be identified in SCCx43KO-/- mice. However, this result was not statistically significant. Claudin-3 and -5 could not be detected immunohistochemically in tubules with SC-only syndrome or arrest of spermatogenesis at the level of spermatogonia. Correspondingly, claudin-3 mRNA expression was significantly decreased (64-fold), whereas claudin-5 mRNA expression showed a milder decrease (1.42-fold), which was not statistically significant. In tubules with residual spermatogenesis showing round spermatids, claudin-11 started developing a finer staining and a shift of the claudin-11 immunostaining towards the BTB was visible. Claudin-5 showed an immunopositive reaction around spermatocytes in tubules with residual spermatogenesis. However, Claudin-3 showed a heterogeneous staining pattern in these tubules, with immunopositive and negative reactions in the basal third of the tubules, apparently independent from the containing GC population. In tubules with qualitatively normal spermatogenesis the staining patterns for all three investigated claudins were similar to that of adult WT mice. While an intact BTB in SCCx43KO-/- mice could already be detected, the altered expression of claudin-3 und -5 indicates an impaired dynamic of the BTB. Despite the diffuse distribution, claudin-11 seems to form intact TJ. Observations from the tubules with residual spermatogenesis let suggest a regulation of the TJ proteins by GC populations.

 

In the second part of the present study, the initial formation of the BTB was investigated in peripubertal SCCx43KO-/- mice. For this purpose, immunohistochemical stainings and qRT-PCR of claudin-11 were carried out in adolescent SCCx43KO-/- and WT mice. Additionally, functional investigations were performed to determine the integrity of the BTB in these mice. These analyses revealed that SCCx43KO-/- mice form an intact BTB during puberty in the same time period as WT mice. While a basal shift of claudin-11 immunoreaction could be observed from day 12 p. p. onwards in WT mice, the SCCx43KO-/- mice showed a diffuse distribution pattern over the whole investigation period (day 2–23 p. p.). There were no significant differences in mRNA levels between both genotypes at days 2–14 p. p. But there was a slight trend of a higher claudin-11 mRNA expression in SCCx43KO-/- mice at day 14 p. p. Additionally, the results from functional investigations indicated an accelerated establishment of the BTB in SCCx43KO-/- mice.

 

In conclusion, the findings of the present study provide evidence of an impaired dynamic of the BTB in SCCx43KO-/- mice, but it remains still unclear whether it is the cause or the consequence of the spermatogenic impairments. Finally, it was shown for the first time that SCCx43KO-/- mice form an intact BTB during puberty, which however seems to be accelerated, compared to WT mice.

keywords

Männliche Infertilität, Connexin43, Blut-Hoden-Schranke; male infertility , connexin43, blood-testis barrier

kb

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