Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Franziska Heinrich

In vitro phenotypical and transcriptomic characterization of canine

macrophages

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108106

title (ger.)

In vitro phänotypische und transkriptomische Charakterisierung von kaninen Makrophagen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/heinrichf_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Makrophagen stellen eine außerordentlich heterogene Zellpopulation mit einer beachtlichen Plastizität und funktionellen Diversität dar. In Nagetiermodellen und beim Menschen werden zwei unterschiedliche Phänotypen von Makrophagen unterschieden, welche direkt von dem umgebenen Mikromilieu beeinflusst werden. In diesem Zusammenhang werden zum einen der pro-inflammatorische M1-Phänotyp und zum anderen der anti-inflammatorische M2-Phänotyp unterschieden. Dennoch gibt es bislang nur wenige Erkenntnisse über die Polarisierung von Makrophagen bei zentralnervösen und anderweitigen Erkrankungen beim Hund.

Ziel der vorliegenden PhD-These war (i) eine eingehende Beschreibung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften einer permanenten Makrophagenzellline vom Hund (DH82) in Abhängigkeit von der Passage sowie (ii) eine umfassende Charakterisierung von in vitro polarisierten Makrophagen des Hundes mit besonderer Berücksichtigung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften, der Beurteilung von prototypischen Markern von Maus und Mensch zur Eignung einer gezielten Differenzierung von M1- und M2-Makrophagen des Hundes sowie  der Beschreibung eindeutiger polarisationsabhängiger Transkriptomprofile und polarisationsspezifischer Biomarker mithilfe von Microarray-Analysen.

Der erste Teil der These bewertete die Eignung einer permanenten Makrophagenzellline des Hundes (DH82) als allgemeines Modell zur Untersuchung von Makrophagen des Hundes in vitro. Generell sind die bislang bekannten Daten über die Oberflächenmarkerexpression von DH82-Zellen trotz ihrer weitverbreiteten Verwendung in der Forschung lückenhaft und teilweise widersprüchlich. Daher wurden die morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von DH82-Zellen unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses der Passagezahl eingehend untersucht. Frühe (≤ 13) und späte (≥ 66) Passagen von DH82 wurden unter Standardbedingungen kultiviert und für die anschließende rasterelektronenmikroskopische und durchflusszytometrische Analyse vorbereitet. Die morphologischen Studien ergaben deutliche passageabhängige Unterschiede der DH82-Zellen, da Zellen der frühen Passagen überwiegend runde Zellkörper mit einer Vielzahl von kleinen zytoplasmatischen Ausläufern aufwiesen, während Zellen der späten Passagen eine spindelförmige Morphologie mit wenigen prominenten Zellausläufern aufwiesen. In der phänotypischen Untersuchung nahm der Prozentsatz positiver Zellen für die Oberflächenmarker CD11c, CD14, CD18, CD45 und CD80 in den späten Passagen signifikant ab. Diese Ergebnisse belegen, dass es deutliche morphologische und phänotypische Unterschiede bei DH82-Zellen in Abhängigkeit von der Passage gibt, welche die gegensätzlichen Berichte aus der Literatur zumindest zum Teil durchaus erklären. In diesem Zusammenhang eignen sich DH82-Zellen der frühen Passagen möglicherweise besser zur Untersuchung von Makrophagen-spezifischen Fragestellungen.

Im zweiten Teil der These wurde eine umfassende Untersuchung der morphologischen, phänotypischen und transkriptionellen Eigenschaften von in vitro polarisierten Makrophagen des Hundes vorgenommen. Dazu wurden Monozyten aus dem Blut von 6 gesunden Hunden mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend unter dem Einfluss von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen über 7 Tage zu M1- und M2-Makrophagen kultiviert. Um M1-Makrophagen zu erhalten wurden die Zellen mit 5 ng/ml Granulozyten Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF), 20 ng/ml Interferon γ (IFNγ) und 100 ng/ml Lipopolysaccarid (LPS) stimuliert. M2-Makrophagen wurden durch eine Behandlung mit 25 ng/ml Makrophagen-Koloniestimulierendem Faktor (M-CSF) und 20 ng/ml Interleukin (IL)-4 generiert. Unstimulierte Makrophagen (M0) erhielten bis auf einen Mediumwechsel alle zwei Tage keine Zusätze. Im Anschluss wurden die Zellen geerntet und für die rasterelektronenmikroskopische und immunfluoreszenzmikroskopische Analyse sowie für die RNA-Isolation vorbereitet.

In der ultrastrukturellen Untersuchung wurden vier unterschiedliche Morphologien festgestellt, nämlich kleine/runde, amöboide und spindelförmige Makrophagen sowie multinukleäre Riesenzellen, welche den jeweiligen M0-, M1- und M2-Makrophagenkulturen eindeutig zugeordnet werden konnten. Die immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchung mit literaturbasierten humanen und murinen Antikörpern gegen CD16, CD32, iNOS, MHC-II (M1-Marker), CD163, CD206 und Arginase-1 (M2-Marker) ergab, dass MHC-II zwischen M2- und M0-Makrophagen unterschied, aber nur CD206 in der Lage war, M2-Makrophagen sowohl von M0- als auch von M1-Makrophagen zu unterscheiden. In der weiterführenden globalen Microarray-Analyse wurden eindeutige Profile der M0-, M1- und M2-Makrophagen auf Transkriptomebene festgestellt, welche sich funktionell insbesondere auf vielfältige Prozesse des Zellstoffwechsels bezogen. Die hierarchische Clusteranalyse deckte ein M1-spezifisches Cluster auf, welches funktionell mit dem Begriff “respiratory burst” assoziiert war, wohingegen ein M2-spezifisches Cluster mit Zellzyklus- und Mitose-Prozessen verbunden war. Im Vergleich von ausgewählten kaninen M1-/M2-Genen mit literaturbasierten humanen und murinen Genen wurden nur geringfügige Überschneidungen in der polarisationsabhängigen Genexpression festgestellt, die darauf hindeuten, dass große speziesspezifische Unterschiede bestehen. Die Detektion von polaritätsspezifischen Biomarkern ergab, dass Latexin (LXN) und Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 2 (MS4A2)die geeignetsten Marker zur Identifizierung des M1- und M2-Phänotyps bei kaninen Makrophagen darstellen.

Die Ergebnisse dieser Studien heben hervor, dass deutliche Unterschiede in humanen, murinen und kaninen Makrophagen im Anschluss an die Polarisierung bestehen, welche weiterführende in vivo und in vitro Untersuchungen zur Ermittlung der biologischen Relevanz der detektierten Biomarker erfordern. Darüber hinaus wurde CD206 als ein vielversprechender Marker zur Differenzierung von kaninen M2-Makrophagen sowohl auf Transkriptom- als auch auf Proteinebene vorgestellt.

Zusammengefasst betrachtet, verdeutlichen die Ergebnisse beider Studien die wichtige Bedeutung des Hundes als translationales Modell für gleichartige humane Erkrankungen und bilden eine solide Basis für zukünftige Studien mit besonderem Hinblick auf kanine Makrophagen.

 

abstract (englisch)

Macrophages represent a heterogeneous cell population with outstanding plasticity and functional diversity. Clearly contrasting phenotypes, i.e. the pro-inflammatory M1-phenotype and the anti-inflammatory M2-phenotype, have been described in rodents and humans, and their occurrence strongly depends on the micromilieu. However, there is a considerable gap of knowledge with respect to macrophage polarization in CNS and non-CNS diseases of dogs.

Therefore, the aims of the present thesis were to (i) deeply characterize the passage-dependent morphologic and phenotypic properties of a  permanent canine macrophage cell line (DH82 cells) in vitro and to  (ii) comprehensively characterize the polarization properties of canine  polarized macrophages in vitro with special emphasis upon the morphologic and phenotypic characterization, the evaluation of the suitability of human and murine prototypical markers to differentiate between canine M1- and M2-macrophages, and the identification of distinct polarization-dependent transcriptomic profiles and  polarization-specific biomarkers, employing microarray technique.

The first part of this thesis focused on the validation of a canine permanent macrophage cell line (DH82 cells) as an appropriate model to study canine macrophages under in vitro culture conditions. Despite its frequent use, the recently reported data on cell surface antigen expression of this cell line are fragmentary and in part inconsistent. Therefore, this study aimed to analyze the morphological and antigenic properties of DH82 cells with respect to passage-dependent differences. Early (≤ 13) and late (≥ 66) passages of DH82 cells were cultured under standard conditions, harvested, and prepared for scanning electron microscopy and flow cytometric analysis, respectively. Morphologically, early passages of DH82 cells exhibited round cell bodies with abundant small cytoplasmic projections whereas later passages obtained a spindle-shaped morphology with large processes. In the phenotypic investigation, the percentage of CD11c-, CD14-, CD18-, CD45-, and CD80-positive cells significantly decreased in late passages. These results demonstrate distinct morphologic and antigenic variances in DH82 cells depending on the passage number which might in part explain the divergent reports on cell surface marker expression in the literature. Thus, DH82 cells from the early passage might be more appropriate for macrophage-related questions.

The second part of the thesis comprehensively investigated the morphologic, phenotypic, and transcriptomic characteristics of canine M0-, M1-, and M2-polarized macrophages in vitro. Monocytes were isolated via density gradient centrifugation from the peripheral blood of 6 healthy Beagles and cultured in vitro for 7 days towards M1-/M2-macrophages by stimulation with pro- and anti-inflammatory cytokines, respectively. M1-macrophages were obtained following treatment with 5 ng/ml granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), 20 ng/ml interferon γ (IFNγ), and 100 ng/ml lipopolysaccaride (LPS). M2-macrophages were produced by treatment with 25 ng/ml macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and 20 ng/ml interleukin (IL)-4. Unstimulated macrophages (M0) did not receive any substitution except medium change every second day. Subsequently, cells were harvested and prepared for scanning electron microscopy, immunofluorescence, and RNA isolation, respectively.

Scanning electron microscopy revealed four different morphologies, i.e. small/roundish, amoeboid, and spindleoid macrophages, and multinucleated giant cells (MNGs), in the M0-, M1-, and M2-treated cultures, respectively. Immunofluorescence labeling  with literature-based human and murine prototype antibodies directed against CD16, CD32, iNOS, MHC class II (M1-markers), CD163, CD206, and arginase-1 (M2-markers) pointed out, that MHC class II discriminated between M2- and M0-macrophages, but only CD206 was able to discriminate M2-macrophages from both M0- and M1-macrophages. The subsequent global microarray analysis identified distinct transcriptomic profiles of canine M0-, M1-, and M2-macrophages, functionally related to multiple processes of the cellular metabolism. Hierarchical clustering analysis demonstrated that a M1-specific cluster was functionally related to the biological process “respiratory burst”, whereas a M2-cluster was associated with “cell cycle processes” and “mitosis”. The comparison of selected canine genes with literature-based human and murine data resulted in minor intersections in the polarization-dependent gene expression, thus indicating marked species-specific differences. Biomarker selection predicted latexin (LXN) and membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 2 (MS4A2) as the most promising biomarkers for M1-/ M2-macrophages, respectively.

The results of this thesis pointed out that there exist marked interspecies differences in human, murine, and canine macrophages following polarization. To close this gap, future in vitro and in vivo studies are urgently needed to assess the full biological relevance of the detected biomarkers. Moreover, the second part of the thesis emphasized CD206 as a promising marker for the differentiation of canine M2-macrophages, both on the transcriptome and protein level.

Conclusively, the results of both parts of the present thesis emphasize the role of the dog as a translational animal model and provide a solid basis for prospective studies with a focus upon canine macrophages.

 

keywords

kanine Makrophagen, Polarisierung, Microarray-Analyse; canine macrophages, polarization, microarray analysis

kb

6.480