Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Florian Heinrich Hansmann

 

Investigation of murine and canine glia cell differentiation in vitro and in vivo

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103031

title (ger.)

Untersuchungen zur in vitro und in vivo Differenzierung muriner und kaniner Gliazellen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hansmannf_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Zelltransplantation stellt eine erfolgversprechende Behandlungsstrategie für demyelinisierende und degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie Multiple Sklerose oder Rückenmarksverletzungen dar. Eine umfassende in vitro Charakterisierung der zu transplantierenden Zellen stellt einen ersten und wichtigen Schritt vor der Untersuchung des Verhaltens und des therapeutischen Potentials der Zellen in vivo dar. Daher verfolgte diese Arbeit im Wesentlichen drei Ziele:

1.)     In vitro und in vivo Charakterisierung von kaninen, olfaktorischen Hüllzellen, die einen vielversprechenden Kandidaten für die Zelltransplantation darstellen.

2.)     Die Etablierung eines Ethidiumbromid (toxischen) induzierten Mausmodells, um die Vorgänge während der De- und Remyelinisierung zu untersuchen und um das Verhalten der oligodendroglialen Vorläuferzelllinie BO-1 in vivo zu testen.

3.)     “Theiler’s murine encephalomyelitis virus“ (TMEV) infizierte Astrozyten und Mikroglia der Maus im Verlauf der Infektion in vitro zu untersuchen, um den Phänotyp der Mikroglia und dessen möglichen Einfluss auf die Hemmung oder Progression von entzündlichen/demyelinisierenden Erkankungen des ZNS zu charakterisieren.

In der ersten Studie wurde eine Charakterisierung von kaninen, olfaktorischen Hüllzellen (OECs) in vitro und in vivo unter Verwendung der Zellmarker p75NTR und CNPase mittels quantitativer PCR, Western Blot und Immunhistochemie durchgeführt. Als Zellen wurden OECs verwendet, da diese geeignete Kandidaten für einen regenerativen Therapieansatz darstellen. Derzeit ist kein stabil exprimierter Marker für die in vivo Detektion von kaninen OECs beschrieben. Die vorliegende Studie zeigte, dass CNPase einen geeigneten Marker für die in vivo Identifikation von kaninen OECs darstellt. Im Gegensatz zu CNPase wurde der Neurotrophin-Rezeptor p75 bei Hunden vor allem in perineuralen Zellen und nur von einigen neonatalen OECs in vivo exprimiert. Allerdings wiesen kanine OECs eine Hochregulation dieses Markers bei längerer Kultivierung in vitro auf. p75NTR könnte somit als Marker zur Detektion von kaninen OECs in vitro verwendet werden. Im Gegensatz zu den kaninen OECs zeigten Ratten OECs keine CNPase-Expression. Hierbei handelte es sich um einen wesentlichen, Spezies-spezifischen Unterschied. CNPase könnte somit als Marker für die Unterscheidung von OECs und Schwann Zellen (SCs) bei der Ratte verwendet werden.

In der zweiten Studie wurde ein Ethidiumbromid induziertes (toxisches) Entmarkungsmodell im kaudalen Kleinhirnstiel (CCP) der Maus etabliert. Dieses Modell stellt ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Pathogenese von De- und Remyelinisierung dar und kann unter anderem verwendet werden, um den Einfluss von Zellen und/oder Substanzen im Verlauf von Entmarkungserkrankungen zu untersuchen. Der CCP wurde aus folgenden Gründen gewählt: 1) Es handelt sich um eine anatomisch gut umschriebene Region, 2) die Axone in dieser Lokalisation weisen einen ähnlichen Durchmesser sowie eine ähnliche Orientierung auf und 3) die Myelinscheiden zeigen eine ähnliche Dicke. In dem Versuch wurden Ethidiumbromid-Konzentrationen zwischen 0,1 und 0,01% in einem Volumen von 2µl stereotaktisch appliziert. Die Mäuse wiesen im CCP eine Konzentrations-abhängige Läsionsgröße nach Ethidiumbromid-Applikation auf. Für die Etablierung eines geeigneten Entmarkungsmodells ist es wichtig, eine Ethidiumbromid-Konzentration zu wählen, die hoch genug ist um eine signifikante Entmarkung hervorzurufen aber keinen ausgeprägten Axonschaden induziert. Für die weiteren Experimente wurde eine Ethidiumbromid Konzentration von 0,025% gewählt, da bei dieser Konzentration eine ausgeprägte Entmarkung sowie ein gering- bis mittelgradiger Axonschaden beobachtet wurde. Das Auftreten von Axonschäden bei der Maus steht im Widerspruch zu publizierten Daten bei der Ratte und stellt einen wichtigen, Spezies-spezifischen Unterschied dar. Des Weiteren wurde die murine Oligodendrozyten- Vorläuferzelllinie BO-1 mit grünfluoreszierendem Protein (EGFP) in vitro transfiziert und stereotaktisch 4 Tage nach der Ethidiumbromid-Applikation in den CCP transplantiert. 17 Tage nach Transplantation wiesen alle BO-1 transplantierten Tiere ein reduziertes Allgemeinbefinden und einen Gewichtsverlust auf und wurden aus ethischen Gründen euthanasiert. In allen BO-1 transplantierten Tieren wurde ein infiltrativ wachsendes, murines Riesenzell-Glioblastom festgestellt. Immunhistologisch wurde in den Tumorzellen eine starke Expression von eGFP festgestellt, die bestätigte, dass es sich bei den Tumorzellen um BO-1 Zellen handelte. Darüber hinaus zeigten die BO-1 Zellen eine starke Expression von PDGFR-α, NG-2 und p53 während nur wenige Zellen saures Gliafaserprotein oder basisches Myelinprotein exprimierten. Die CNPase-Expression der BO-1 Zellen war in vivo im Vergleich zu in vitro reduziert. Um zu bestätigen, dass die beobachtete Tumorbildung nicht die Folge der vorangegangenen Ethidiumbromid-Anwendung war, wurden BO-1-Zellen in den normalen, nicht-demyelinisierten CCP transplantiert. Dieser Ansatz führte erneut zur Entstehung eines murinen Riesenzell-Glioblastoms. Die beobachtete Markerexpression der BO-1 Zellen nach Transplantation zeigte, dass die entmarkte Umgebung nicht ausreicht, um eine Differenzierung von BO-1 Zellen in myelinisierende Oligodendrozyten zu induzieren. Obwohl BO-1 Zellen für eine regenerative Therapie ungeeignet sind, könnten diese Zellen ein gutes Modell für die Untersuchung von malignen Gliomen darstellen.

In der dritten Studie wurden murine Mikroglia und Astrozyten in vitro hinsichtlich ihres Zytokinexpressionsprofils nach TMEV-Infektion untersucht. Dieses Experiment zielte darauf ab, den Mikroglia Phänotyp (M1=entzündungsfördernd, M2=entzündungs-hemmend) infolge TMEV-Infektion in vitro zu charakterisieren. Mikroglia sollen einen wesentlichen Einfluss auf das vorherrschende Milieu im zentralen Nervensystem haben und sind somit bedeutsam für den Verlauf von entzündlichen/demyelinisierenden Erkrankungen. In dieser Studie wurde in Astrozyten in der Frühphase nach TMEV Infektion eine Hochregulation der IL-1, IL-12 und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) mRNS-Transkripte festgestellt. Dieser Befund spricht für das Vorliegen einer Th-1-ähnlichen Immunantwort. Im Gegensatz dazu wurde zeitglich bei Mikroglia eine hohe Menge an IL-10 und eine geringe Menge an IL-12 mRNS-Transkripten festgestellt. Dieses Expressionsprofil spricht für das Vorliegen des entzündungshemmenden M2-Phänotyps. 240 Stunden nach TMEV Infektion zeigten die Mikrogliazellen eine hohe Menge an IL-12 und eine geringe Menge an IL-10 mRNS, was auf eine Phänotyp-Änderung der Mikroglia zum M1-Typ hindeutet. Es bleibt spekulativ, ob Astrozyten, die eine hohe Empfänglichkeit für eine TMEV Infektion aufweisen, in vivo einen frühe Phänotyp-Änderung der Mikroglia hervorrufen können und dadurch die Entstehung einer chronisch-progressiven Rückenmarksentzündung mit Entmarkung begünstigen. Darüber hinaus könnte die in Astrozyten und Mikroglia beobachtete, gleichzeitige Expression von TNF und seinen Rezeptoren einen autokrinen Rückkopplungsmechanismus darstellen, der eventuell mit einem entzündungsfördernden Verhalten von Astrozyten über den TNF Rezeptor 1 verbunden ist. 

 

abstract (englisch)

Cell transplantation represents a promising treatment strategy for demyelinating and degenerative diseases of the central nervous system (CNS) like multiple sclerosis and spinal cord injury. A comprehensive in vitro characterization of cells represents the first and very important step before investigating the behavior and therapeutic potential of transplanted cells in vivo. Therefore, the aims of this thesis were threefold:

1.)    Characterization of canine olfactory ensheathing cells as promising candidates for transplantation in vitro and in vivo.

2.)    Establishment of an ethidium bromide (toxic) induced mouse model to study de- and remyelination and to test the behavior of the oligodendrocyte precursor cell line BO-1 in vivo.

3.)    Studying astrocytes and microglia following infection with Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) in vitro for the characterization of the phenotype of microglia and their possible impact upon the inhibition or progression of inflammatory/demyelinating diseases of the CNS.

Firstly, canine olfactory ensheathing cells (OECs) were characterized in vitro and in vivo employing the cell markers p75NTR and CNPase using quantitative real-time PCR, western blot and immunohistochemistry. OECs were selected because these cells represent suitable candidates for a regenerative therapeutic approach. At present no stable marker for the in vivo identification of OECs exists. The present study revealed that CNPase represents a suitable marker for the in vivo detection of canine OECs. In contrast to CNPase, p75NTR was mainly expressed by perineural cells and only in some neonatal OECs in dogs in vivo. However, canine OECs showed an upregulation of this marker during long term culturing and therefore this marker may serve as a useful tool for the detection of canine OECs in vitro. Furthermore, an important species specific difference was detected. Rat OECs in contrast to canine OECs lacked CNPase expression. Thus this marker may be used to discriminate between SCs and OECs in rats.

Secondly, an ethidium bromide-induced (toxic) demyelination model in the murine caudal cerebellar peduncle was established. This model represents an important tool for the investigation of de- and remyelination and can be further used to evaluate the impact of transplanted cells and/or substances upon the progression of demyelinating diseases. The caudal cerebellar peduncle was chosen because of the following reasons: i) it is a well circumscribed anatomical structure, ii) axons in this localization have a similar diameter and orientation and iii) myelin sheaths show a similar size. Ethidium bromide concentrations between 0.1 and 0.01% in a volume of 2µl were applied stereotactically. A concentration dependent lesion size following ethidium bromide application was observed. For the establishment of a suitable demyelination model it is important to select a concentration which is high enough to induce significant demyelination but the toxicant should spare most of the axons. Therefore, an ethidium bromide concentration of 0.025% was selected at which a marked demyelination and mild to moderate axonal damage was observed. Interestingly, the occurrence of axonal alterations was in contrast to previous published studies in rats and indicates a species specific difference with respect to the mode of action. Next, enhanced green fluorescence protein (EGFP) labeled BO-1 cells were stereotactically transplanted into the CCP 4 days post ethidium bromide application. 17 days post transplantation all BO-1 cell transplanted animals showed reduced general behavior and weight loss and were euthanized due to ethical reasons. In all BO-1 cell transplanted animals an infiltrative murine giant cell glioblastoma was detected at the transplantation site. Immunohistochemistry revealed a strong EGFP expression in the neoplastic cells confirming their BO-1 identity. Furthermore, the majority of BO-1 cells expressed PDGFR-α, NG-2 and p53 while only few cells showed glial fibrillary acidic protein or myelin basic protein expression. In addition CNPase expression was reduced compared to in vitro findings. To confirm, that the observed tumor formation was not the consequence of the ethidium bromide application, BO-1 cells were transplanted into the normal, non-demyelinated CCP. This approach again resulted in the development of a murine giant cell glioblastoma. The observed marker expression of BO-1 cells following transplantation revealed, that the demyelinated environment was insufficient to support the differentiation of BO-1 cells into myelinating oligodendrocytes. Nevertheless BO-1 cells are unsuitable for a regenerative therapy; however they may be used as a versatile model for the investigation of malignant gliomas.

Thirdly, murine microglia and astrocytes were investigated regarding their cytokine expression profile following TMEV infection in vitro. This experiment aimed to determine the phenotype of microglia (M1=pro-inflammatory, M2=anti-inflammatory) following TMEV infection. Microglia are supposed to have a major impact upon the prevailing milieu of the CNS and are therefore important for the progression or inhibition of inflammatory/demyelinating diseases. In the present study astrocytes showed an early upregulation of IL-1, IL-12 and tumor necrosis factor (TNF) mRNA transcripts following TMEV infection indicating a Th-1-like immune response. In contrast, microglia at the same time maintained high IL-10 and low IL-12 mRNA levels suggesting a normal, anti-inflammatory M2 phenotype. At 240 hours post infection microglia showed high IL-12 and low IL-10 mRNA levels indicating a phenotype switch to M1. It remains speculative, whether astrocytes being highly susceptible to TMEV infection favor a phenotype switch of microglia which may contribute to the development of a chronic progressive, demyelinating myelitis. In addition, the simultaneous expression of TNF and its receptors by astrocytes and microglia might generate autocrine feedback loops possibly associated with pro-inflammatory actions of astrocytes via TNF receptor 1. 

 

keywords

Gliom, kanine olfaktorische Hüllzellen, Mikroglia Phenotyp, glioma, canine olfactory ensheathing cells, microglia phenotype

kb

2.388