Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Nina Hanschke

The effect of conjugated linoleic acid (CLA) supplements on the oxidative and antioxidative status of periparturient and lactating dairy cows

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104785

title (ger.)

Der Effekt einer Langzeitsupplementation von konjugierten Linolsäuren auf den oxidativen und antioxidativen Status von Milchkühen während des peripartalen Zeitraumes und der darauffolgenden Laktation

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hanschken_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Während des peripartalen Zeitraumes kommt es zu einer starken Beanspruchung des Stoffwechsels von hochleistenden Milchkühen, was zu einer vermehrten Bildung von stark reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS; engl.: reactive oxygen species) führen kann. Ein Zusammenhang zwischen einer vermehrten Produktion von ROS mit verschiedenen peripartalen Erkrankungen des Milchrindes, wie zum Beispiel Mastitis, wurde bereits mehrfach dargestellt. Basierend auf in-vitro sowie in-vivo Studien an Mensch und Versuchstieren werden antioxidative Eigenschaften von konjugierten Linolsäuren (CLA; engl.: conjugated linoleic acids) derzeit kontrovers diskutiert. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Effekte einer Langzeitsupplementation von CLA über einen Zeitraum von 39 Wochen von CLA auf den antioxidativen und oxidativen Status von Milchkühen und Färsen zu ermitteln. Konjugierte Linolsäuren werden bereits weitläufig eingesetzt, um den beanspruchten Stoffwechsel rund um den Partus durch eine Reduzierung der Milchfettsynthese zu stabilisieren.

Diese Studie wurde am Institut für Tierernährung des Friedrich-Löffler-Institutes in Braunschweig durchgeführt. Dort wurden 32 Milchkühe und 13 Färsen in drei Gruppen eingeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt Stearinsäure als Supplement, die CLA 50 Gruppe 50 g und die CLA 100 Gruppe 100 g einer kommerziellen Mischung unterschiedlicher CLA Isomere, welche zu 10 % trans‑10,cis‑12 CLA und zu 10 % cis‑9,trans‑11 CLA enthielt. Zum Schutz vor ruminaler Biohydrierung befand sich die CLA Mischung in einer Kapsel aus an Glycerin gebundener Palmitin- und Stearinsäure.

Das Fettgemisch wurde in pelletiertes Kraftfutter eingearbeitet, welches vom Tag 1 (ein Tag post partum) bis Tag 182 an Transponder gesteuerten Kraftfutterstationen gefüttert wurde. Mais- und Grassilage sowie die übrigen Futterkomponenten wurden in der Laktation ad libitum und in der Trockenstehzeit bedarfsgerecht als Mischration angeboten. Den Tieren wurden an den Tagen -21, 1, 21, 70, 105, 140, 182, 224 und 252 (im Verhältnis zur Abkalbung) Blutproben aus der Vena jugularis entnommen.

Die statistische Auswertung erfolgte varianzanalytisch für wiederholte Messungen im gemischten Modell mit den fixen Effekten Fütterungsgruppe, Laktationstag und Laktationsnummer (Kuh vs. Färse) sowie deren Interaktionen sowie Tier als Zufallseffekt. Die Versuchszeit wurde in zwei zeitliche Abschnitte geteilt, die getrennt ausgewertet wurden: Phase eins (Tag -21 bis Tag 105) und Phase zwei (Tag 105 bis Tag 252).

In den gewonnenen Blutproben wurden der antioxidative und der oxidative Status gemessen. Parameter, die der Ermittlung des antioxidativen Status dienten, waren die „ferric reducing ability of plasma“ (FRAP), α‑Tocopherol und Retinol. Letztere wurden zum Ausschluss eines Einflusses der Ernährung der Tiere auf den antioxidativen Status bestimmt. Serum Cholesterin Werte wurden zwecks der Berechnung des α‑Tocopherol:Cholesterin Massenverhältnisses gemessen.

Zur Ermittlung des oxidativen Status wurden die Menge der Hydroxide im Serum sowie der Thiobarbitursäure reaktiven Substanzen (TBARS) gemessen. Bei letzteren handelt es sich vorrangig um Endprodukte der Lipidperoxidation-Kettenreaktion inklusive Malondialdehyd. Oxidative Schäden an Proteinmakromolekülen wurden anhand spektrofluorometrischer Messung von N‘‑Formylkynurenin und Bityrosin bestimmt. Als wichtiger Bestandteil vieler Antioxidantien und Indikator für oxidativen Stress wurde die Konzentration von Sulfhydrylgruppen (SH‑Gruppen) im Plasma gemessen.

Die Laktationsphase nahm stets einen signifikanten Einfluss auf den antioxidativen Status in Versuchsphase eins und zwei. Während der Phase eins konnte ein Abfall der Parameter FRAP (p < 0,001), α-Tocopherol (p < 0,001), Retinol (p < 0,001) und des α‑Tocopherol:Cholesterin Massenverhältnisses (p < 0,001) in Bezug auf die herannahende Abkalbung nachgewiesen werden, gefolgt von einem anschließenden Anstieg der Blutwerte. In Phase zwei hingegen nahmen die Blutkonzentrationen von FRAP (p < 0,001), α‑Tocopherol (p < 0,001) und Retinol (p < 0,001) signifikant ab, das α‑Tocopherol:Cholesterin Massenverhältnis blieb jedoch weitgehend konstant (p = 0,35).

Neben dem antioxidativen Status war auch bezüglich des oxidativen Status eine deutliche Variation mit dem Laktationsverlauf zu beobachten. In Phase eins stiegen die Konzentrationen der Hydroxide (p < 0,001), der Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS; p < 0,001) und SH-Gruppen zur Abkalbung hin signifikant an und fielen in der frühen Laktation wieder ab. Sie zeigten somit den umgekehrten Verlauf zu den Antioxidantien. In Phase zwei folgte ein signifikanter, fortschreitender Abfall der oben genannten Substanzen, gefolgt von einem Anstieg nach Absetzen des Supplements; Hydroxide (p < 0,001), TBARS (p < 0,001) und SH‑Gruppen (p < 0,001).

Peroxidative Schäden an Proteinmakromolekülen, gemessen an Plasmakonzentrationen von N‘‑Formylkynurenin (p < 0,001) und Bityrosin (p < 0,001), nahmen in der ersten Phase zur Abkalbung hin signifikant ab, um nach dem erfolgten Partus in der Frühlaktation wieder anzusteigen. In Phase zwei konnte bei beiden Parametern ein signifikanter, fortlaufender Abfall bis zu Ende des Versuchszeitraumes beobachtet werden; N‘‑Formylkynurenin (p < 0,001) und Bityrosin (p < 0,001).

Basierend auf den Ergebnissen dieses Fütterungsversuches, konnten keine signifikanten Unterschiede im antioxidativen oder oxidativen Status zwischen den Tieren der unterschiedlichen Gruppen festgestellt werden. Die einzige Ausnahme bildeten die Plasmakonzentrationen der SH‑Gruppen, welche in Phase eins bei den Tieren der Gruppe CLA 100 tendenziell höher waren (p = 0,085). Diese Tendenz verdeutlichte sich in Phase zwei, dort wurden bei den Tieren der Gruppe CLA 100 signifikant höhere SH‑Gruppen Konzentrationen im Plasma festgestellt (p = 0,021). Da bereits zu Versuchsbeginn die Tiere in der CLA 100 Gruppe im Mittel die höchsten Plasmakonzentrationen der SH‑Gruppen aufwiesen, erscheint ein Effekt durch die CLA Supplementation jedoch unwahrscheinlich.

Zwischen Kühen und Färsen gab es einen signifikanten Unterschied in Bezug auf Serum α‑Tocopherol Konzentrationen in Phase eins (p < 0,001) und in Phase zwei (p < 0,001), wobei Färsen stets höhere Serum Konzentrationen aufwiesen, gleiches galt für das α‑Tocopherol:Cholesterin Massenverhältnis (in Phase eins und zwei: p < 0,001). In Phase zwei wurde des Weiteren deutlich, dass Färsen geringere Serum Konzentrationen von Hydroxiden (p = 0,005) und TBARS (p = 0,013) aufwiesen. Die Konzentration der SH‑Gruppen war in Phase eins (p = 0,024) sowie in Phase zwei (p = 0,004) im Plasma der Färsen höher als in dem der Kühe. Vermutliche Ursache hierfür erscheint eine längere Weideperiode der Färsen unmittelbar vor der Studienaufnahme und somit eine bessere Vitamin E Versorgung als bei den Kühen zu sein, welche vor Studienbeginn nur wenige Wochen auf der Weide gehalten wurden.

Insgesamt kann aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie geschlossen werden, dass Antioxidantien im peripartalen Zeitraum in deutlich reduzierten Konzentrationen im Blut von Milchkühen und Färsen vorliegen. Demgegenüber liegen Oxidationsprodukte, wie Hydroxide oder TBARS, in deutlich höheren Konzentrationen vor. Trotz der verminderten antioxidativen Abwehr scheint es dem Organismus möglich zu sein, Proteine ausreichend vor peroxidativen Schäden zu schützen. Die Ergebnisse geben ferner Aufschluss darüber, dass eine Langzeitsupplementation mit dem oben genannten kommerziellen CLA Gemisch (mit gleichen Mengen an trans‑10,cis‑12 CLA und cis‑9,trans‑11 CLA) in den gewählten Dosierungen während des Puerperiums sowie der nachfolgenden Laktation keinen Effekt auf den antioxidativen oder oxidativen Status von Milchkühen und Färsen hat. Als wahrscheinliche Ursache hierfür wird eine zu geringe Dosis und unzureichender Schutz des Produkts vor ruminaler, mikrobieller Hydrierung angenommen, welche zu einer zu geringen Bioverfügbarkeit der CLA-Isomere führten. Die Ergebnisse dieses Versuches legen weiterhin nahe, dass der Vitamin E Bedarf von hochleistenden Milchkühen womöglich deutlich über den derzeitigen Empfehlungen der GFE (2001) liegt.

abstract (englisch)

Enhanced metabolism, as present in the periparturient period in dairy cows, might result in an increase of reactive oxygen species (ROS), which are thought to play an important role in various production diseases, such as mastitis. Since antioxidative properties of conjugated linoleic acids (CLA) are discussed controversially, the aim of the presented study was to investigate effects of supplementation of conjugated linoleic acids (CLA) to dairy cows and heifers on their antioxidative and oxidative status. Conjugated linoleic acids are widely used in dairy cattle feeding, to stabilise metabolism in the transition period, by reducing milk fat synthesis.

This study was carried out with German Holstein cows (n = 32) and heifers (n = 13), randomly assigned to three groups, receiving a control fat (n = 14), 50 g (n = 15) or 100 g (n = 16) of a mixture of CLA isomers, containing 10 % trans‑10,cis‑12 CLA and 10 % cis‑9,trans‑11 CLA. Stearic acid was used as control fat. The CLA mixture was encapsulated with palmitic acid and stearic acid, both linked to glycerine to protect CLA supplements from rumen biohydrogenation. Blood samples were taken from the jugular vein at day -21, 1, 21, 70, 105, 140, 182, 224 and 252 relative to calving. Animals were supplemented between d 1 and d 182. Statistical analysis between groups was done separately for period one (d -21 until d 105) and period two (d 105 until d 252). Differences with days in milk (DIM) and between cows and heifers of all groups were also evaluated.

In the obtained blood samples the antioxidative and oxidative statuses of these animals were determined. For identification of the antioxidative status the ferric reducing ability of plasma was determined, as well as serum concentrations of αtocopherol and retinol. The latter were determined to rule out the possibility that differences in antioxidative or oxidative statuses were caused by nutritional antioxidants. Serum cholesterol concentrations were determined for the calculation of the αtocopherol:cholesterol ratio.

The oxidative status was determined by measurement of the amount of hydroxide radicals in the serum and lipid peroxidation end products, using the thiobarbituric acid (TBA) test. Peroxidative damage to proteins was also determined by means of N′‑formylkynurenine and bityrosine. Plasma sulfhydryl groups (SH groups) were determined as an indicator of oxidative stress.

Stage of lactation influenced parameters of the antioxidative status over both periods one and two. During period one the antioxidative parameters significantly decreased towards parturition with a subsequent increase; FRAP (p < 0.001), retinol (p < 0.001), αtocopherol (p < 0.001) and αtocopherol:cholesterol mass ratio (p < 0.001). During period two, the antioxidative status significantly decreased towards the end of the trial, including FRAP (p < 0.001), retinol (p < 0.001) and αtocopherol (p < 0.001), but not the αtocopherol:cholesterol mass ratio, which remained constant (p = 0.35).

Oxidative parameters were significantly influenced by stage of lactation over both periods. During period one, the amount of hydroperoxides (p < 0.001), TBARS (p < 0.001) and plasma SH groups (p < 0.001) showed the inverse pattern of the antioxidative substances, with a significant increase towards parturition and a subsequent decrease. The decrease continued through to period two, with an increase during depletion period for amount of hydroperoxides (p < 0.001), TBARS (p < 0.001) and plasma SH groups (p < 0.001). In period one protein peroxidation parameters, bityrosine (p < 0.001) and N′‑formylkynurenine (p < 0.001) declined towards parturition and increased during early lactation, whereas in period two both parameters declined towards the end of the trial; bityrosine (p < 0.001) and N′‑formylkynurenine (p < 0.001).

There were no significant differences in the determined antioxidative or oxidative parameters between animals of different groups, apart from SH group concentrations. The cows of the CLA 100 group tended to have higher SH group concentrations than the other groups during period one (p = 0.085) and had significantly higher SH group concentrations during period two (p = 0.021). Since animals of the CLA 100 group exhibited the highest average plasma concentrations of SH groups before the CLA supplementation started, it is unlikely that the observed group effect for SH groups was due to the CLA supplementation.

Differences between cows and heifers were detected for serum αtocopherol concentrations during periods one (p = 0.012) and period two (p < 0.001), with heifers exhibiting higher αtocopherol concentrations and a higher αtocopherol:cholesterol mass ratio (both periods p < 0.001). During period two, heifers were detected with lower serum concentrations of hydroperoxides in the sample (p = 0.005) and TBARS (p = 0.013). Plasma SH group concentrations were significantly higher in heifers than in cows in periods one (p = 0.024) and two (p = 0.004). A likely explanation for the observed differences is the longer pasture feed period before the study start for the heifers of the present study (about three months) compared to multiparous cows, which were only on pasture for a few weeks, between dry off and enrolment for the present study, leading to a higher vitamin E supply in heifers.

Overall, antioxidants were diminished during the periparturient period in dairy cows and heifers of this trial, while oxidants, such as hydroxides, and lipid peroxidation were markedly increased. Even though antioxidants were reduced, the antioxidant defence system could effectively protect proteins from peroxidation. The results of this study also revealed that long term supplementation of a commercial mixture of CLA isomers, containing equal amounts of trans‑10,cis‑12 CLA and cis‑9,trans‑11 CLA, had no effect on the antioxidative and oxidative status of dairy cows during the periparturient period and on-going lactation. This was possibly due to the too low CLA dosage combined with insufficient protection of the CLA supplement against ruminal biohydration, leading to poor bioavailability of the CLA isomers. Results suggest further that vitamin E requirements of pregnant and lactating dairy cows exceed the German recommendations published by GFE (2001) by far.

keywords

Oxidativer Stress, Milchkuh, konjugierte Linolsäuren, Oxidative stress, dairy cow, conjugated linoleic acids

kb

1.600