Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Yohannes Haile

 

In vitro and in vivo evaluation of polySia and polySia based hydrogel in terms of survival, proliferation and differentiation of primary neurons and glial cells, immunological reaction and nerve regeneration

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-94939

title (ger.)

In vitro und in vivo Untersuchungen zu PolySia und PolySia-basierten Hydrogelen mit Blick auf Überleben, Proliferation und Differenzierung primärer Neurone und glialer Zellen, Immunreaktion und Nervenregeneration

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2007

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hailey_ws07.pdf

abstract (deutsch)

Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel der Entwicklung eines neuen, biokompatiblen und bioresorbierbaren Materials für das Tissue Engineering peripherer Nerven basierend auf Polysialin Säure (PolySia), einem Homopolymer a2, 8-verknüpfter Sialinsäure-Reste.

Zur Erreichung dieses Zieles wurden zunächst Protokolle zur effektiven Beschichtung von Zellkultur-Oberflächen mit löslicher PolySia etabliert. Zusätzlich wurden primäre Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems, wie neonatale und adulte Schwann-Zellen, neurale Progenitorzellen, Dorsalwurzelganglien-Neurone und embryonale, spinale Motoneurone, welche alle mögliche Kandidaten für rekonstruktive Therapien sind, auf PolySia-Substraten kultiviert. Die jeweiligen Zellkulturen wurden bezüglich des Zellüberlebens und der Zellproliferation untersucht. PolySia war unter den gewählten Kulturbedingungen stabil. Induzierter Abbau von PolySia und deren Abbauprodukte hatten keine negativen Effekte auf die Zellkulturen. Darüber hinaus zeigte der Einsatz von PolySia als Zellkultursubstrat Kompatibilität mit den gewählten unterschiedlichen Ratten-Zelltypen aus embryonalem, postnatalem und adultem Gewebe des zentralen und peripheren Nervensystems.

In einem zweiten Schritt wurde ein auf PolySia basierendes Hydrogel durch Quervernetzung mit Diepoxyoktan hergestellt. Die Mikrostruktur der Hydrogel-Oberfläche wurde mittels Elektronenmikroskopie charakterisiert und zeigte die erhaltene Topographie von PolySia, wie sie bereits von anderen Autoren beschrieben wurde. Das PolySia-Hydrogel ist durch das Enzym Endoneuraminidase vollständig abbaubar, dies könnte bei Einsatz in rekonstruktiven Therapien eine Operation zur Explantation von Nervenschienen nach der Geweberegeneration vermeiden helfen. Viabilitäts-Essays demonstrierten, dass die löslichen Komponenten des PolySia-Hydrogeles keinerlei toxische Effekte auf Schwann-Zellen in vitro hatten. Vielmehr war es mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) tranfizierten neonatalen und adulten Schwann-Zellen, neuralen Progenitor-Zellen sowie Dorsalwurzelganglien zellen (unmarkiert) möglich auf mit Poly-L-Lysin, Poly-L-Ornithin-Laminin oder Kollagen modifiziertem PolySia-Hydrogel zu adherieren und zu wachsen. Der WST-1-Essay (wasser-lösliches Tetrazolium-Salz) zeigte, dass die Modifikation des Hydrogels die Zelladhäsion und Viabilität dieser primären neuronalen und glialen Zellen signifikant verbesserte.

Eine in vivo-Untersuchung wurde durchgeführt um den Einfluss oder die Beteiligung von PolySia und PolySia-basiertem Hydrogel auf oder an der peripheren Nervenregenration und die Immunreaktion zu untersuchen. Die makroskopische Untersuchung der explantierten Silikon-Nervenschienen, drei Wochen nach Transplantation, demonstrierte, dass alle Tiere, denen Nervenschienen gefüllt mit einem Gemisch aus löslicher PolySia und Matrigel implantiert worden waren, regeneriertes Gewebe enthielten, das die 10 mm große Lücke in den Nn. ischiadici adulter Ratten überbrückte. Im Gegensatz dazu wurde keine Geweberegeneration beobachtet, wenn den Tieren Nervenschienen gefüllt mit PolySia-Hydrogel transplantiert wurden. Ausserdem zeigten immunhistologische Untersuchungen des regenerierten Gewebes das PolySia oder PolySia-Hydrogel in vivo, im Vergleich zu Kontrollbedingungen mit Implantation von Matrigel-gefüllten Nervenschienen, nicht die Immunreaktion erhöhten. Diese Ergebnisse beweisen, dass PolySia in vivo immunologisch inert ist und demonstrieren dessen Biokompatibilität und Potential für die Verwendung als Ummantelung im Tissue engineering peripherer Nerven.

 

abstract (englisch)

The recent study follows the aim to develop a novel, biocompatible, and bioresorbable material for peripheral nerve tissue engineering based on polysialic acid (polySia), a homopolymer of alpha 2, 8-linked sialic acid residues. To reach this goal, at first protocols for efficient coating of cell culture surfaces with soluble polySia were established. In addition, primary cells of the central and peripheral nervous system such as neonatal and adult Schwann cells, neural progenitor cells, dorsal root ganglionic neurons and embryonic spinal motoneurons which are all possible candidates for reconstructive therapies were cultured on polySia substrates. Respective cell cultures were evaluated with regard to cell survival and cell proliferation. PolySia turned out to be stable under cell culture conditions. Induced degradation of PolySia and its degradation products had no negative effects on cell cultures. Furthermore, polySia used as a cell culture substrate revealed its compatibility for the chosen several rat cell types derived from embryonic, postnatal and adult tissue of the central and peripheral nervous system.

In a second attempt, a polySia based hydrogel was formed by cross-linking with diepoxyoctane. The surface microstructure of the hydrogel was characterized by means of scanning electron microscopy and maintained the topography of polySia reported elsewhere. PolySia hydrogel is completely degradable by endosialidase enzyme which may help to avoid explantation surgery of nerve guides after tissue recovery when used in reconstructive therapies. Viability assay demonstrated that the soluble components of polySia hydrogel did not cause any toxic effect on cultured Schwann cells in vitro. Moreover, green fluorescence protein (GFP) transfected neonatal and adult rat Schwann cells, neural progenitor cells as well as dorsal root ganglia cells (unlabelled) were able to adhere and grow on polySia hydrogel modified with poly-L-lysine, poly-L-ornithine-laminin or collagen. Water soluble tetrazolium salt assay (WST-1) revealed that modification of the hydrogel significantly improved cell adhesion and viability of these primary neural and glial cells.

An in vivo study was performed to assess the impact or contribution of polySia and polySia based hydrogel in peripheral nerve regeneration and immunological reaction. Macroscopic analysis of the explanted silicone nerve guides three weeks after surgery demonstrated that all animals transplanted with a mixture of soluble polySia and Matrigel inside the nerve guides showed tissue cable regeneration bridging a 10 mm gap in sciatic nerves of adult rats. In contrast, none of the animals transplanted with nerve guides filled with polySia hydrogel exhibited tissue cable growth. Furthermore, immunohistological analysis of the regenerated tissue indicated that in vivo introduction of polySia or polySia based hydrogel did not change immunological reaction as compared to the control transplanted with matrigel-filled silicone nerve bridges. These results prove the immunologic inertness of polySia in vivo and demonstrate its biocompatibility and potential to be used as scaffold material in peripheral nerve tissue engineering.

 

keywords

Polysialinsäure, Nervenregeneration, Gliale Zellen; polysialic acid, nerve regeneration, gilial cells

kb

1.997