Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Kerstin Caroline Hahn

In vitro and in vivo characterization of pathomechanisms of inherited neurodegenerative

disorders in dogs

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106439

title (ger.)

In vitro und in vivo Charakterisierung der Pathomechanismen von erblichen, neurodegenerativen Erkrankungen des Hundes

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hahnk_ss15.pdf

abstract (deutsch)

In letzter Zeit gewinnt die Spezies Hund bezüglich der Verwendung als translationales Modell in der Neurowissenschaft zunehmend an Bedeutung. Dies resultiert aus Parallelen in der Organisation des kaninen und humanen Nervensystems sowie des Genoms. Darüber hinaus ermöglicht die Charakterisierung von Genen, die bekanntlich mit dem Auftreten definierter Krankheiten beim Menschen assoziiert sind, die Klassifizierung korrespondierender Erkrankungen des Hundes. Diese können dann als Tiermodell für die Erforschung der humanen Erkrankung verwendet werden. Zudem ermöglicht die Charakterisierung erblicher Erkrankungen des Hundes die Identifizierung von neuen Genen. Diese stellen möglicherweise potentielle Kandidatengene für Erkrankungen des Menschen dar, deren genetischer Hintergrund bisher unbekannt ist. Die lysosomale Speicherkrankheit GM1- Gangliosidose wurde erstmals bei Menschen beschrieben. Anhand der detaillierten Untersuchung entsprechender Hundemodelle wurde gezeigt, dass viele Parallelen in der molekularen Pathogenese und Neuropathologie bei der kaninen und humanen Erkrankung bestehen. GM1-Gangliosidose und zahlreiche weitere neurodegenerative Erkrankungen mit erblicher Komponente manifestieren sich unter anderem in den Neuronen der Dorsalwurzelganglien. Kulturen von Dorsalwurzelganglien von Nagern oder Hühnern stellen ein etabliertes System dar, das seit langem für die Erforschung der Pathogenese neurodegenerativer Prozesse und ihrer Beeinflussung durch Gliazellen und/oder Wachstumsfaktoren verwendet wird. Daher war es das Ziel dieser Studie (i) ein Protokoll für die Isolierung und Kultur adulter, kaniner Dorsalwurzelganglienneurone zu etablieren und unter Verwendung dieses Systems die modulierenden Effekte von GM1-Gangliosid (GM1) auf Neuronen und Gliazellen zu untersuchen. Im Zweiten Teil der Studie (ii) erfolgte die klinische, genetische und pathologische Charakterisierung einer bisher nicht beschriebenen, erblichen neuroaxonalen Dystrophie bei Spanischen Wasserhunden.

Die Etablierung eines Protokolls für die Isolierung und Kultivierung kaniner Dorsalwurzelganglienneurone von adulten Hunden stellt ein interessantes in vitro-Modell für die Erforschung der Pathogenese genetisch-bedingter neurodegenerativer Erkrankungen dar. Ein entsprechendes Protokoll wurde erfolgreich etabliert sowie optimiert und für die Charakterisierung von GM1-Gangliosid (GM1), “nerve growth factor“ (NGF) und/oder “fibroblast growth factor“ (FGF) 2 -assoziierten Effekten auf Neurone und Gliazellen verwendet. GM1 stellt einen wichtigen strukturellen und funktionellen Bestandteil intrazellulärer Membransysteme dar. Insbesondere die neuronale Zellmembran sowie das Myelin weisen hohe GM1 Konzentrationen auf. Beeinträchtigungen des lysosomalen GM1 Abbaus sind als initialer Pathomechanismus der lysosomalen Speicherkrankheit GM1-Gangliosidose anzusehen. Zudem werden alters-assoziierte Veränderungen im GM1 Metabolismus im Zusammenhang mit Alterationen von Synapsen sowie des Myelins in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen diskutiert. Anhand der im Rahmen dieser Studie durchgeführten Zellkulturexperimente wurde bei Neuronen, die mit GM1 und NGF inkubiert wurden, ein verstärktes Neuritenwachstum nachgewiesen. Zudem stellten sich Akkumulationen von Synaptophysin und Dynein in den Nervenzellfortsätzen dar. Diese Ergebnisse zeigen, dass GM1 die Synapsenbildung sowie den retrograden, axonalen Transport moduliert. Zudem steigerten NGF und GM1 den prozentualen Anteil Glutamin- Synthetase exprimierender, nicht-neuronaler Zellen in adulten kaninen Dorsalwurzelganglienkulturen. Folglich ist von einem GM1 und NGF-assoziierten Effekt auf den extrazellulären Glutamatspiegel auszugehen. Dieser moduliert möglicherweise die Ausbildung ektopischer Neuriten, deren Auftreten bei der GM1-Gangliosidose beschrieben wurde. Unter FGF2 supplementierten Kulturbedingungen stellte sich ein erhöhter Anteil “glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) exprimierender, nicht-neuronaler Zellen dar. Zellen, die mit GM1 und FGF2 kultiviert wurden, zeigten einen signifikant niedrigeren Anteil GFAP-positiver Zellen. Daher schient FGF2 eine astrozytäre Differenzierung von Gliazellen zu fördern, die durch GM1 inhibiert wird. Dies impliziert, dass GM1 möglicherweise die Bildung von glialem Narbengewebe hemmt. Die Relevanz dieser vorläufigen Ergebnisse muss allerdings in weiteren Studien bestätigt werden.

Die klinische, genetische und pathologische Charakterisierung einer erblichen NAD bei Spanischen Wasserhunden erfolgte im zweiten Teil dieser Studie. Sie ermöglicht die Beurteilung der Relevanz dieser rassespezifischen Erkrankung als translationales, kanines in vivo Modell für NAD Formen des Menschen. Anhand genetischer Analysen wurde gezeigt, dass die NAD Spanischer Wasserhunde durch eine Mutation im “Tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2“ (TECPR2) Gen verursacht wird. Die NAD Spanischer Wasserhunde zeigt ätiologische und klinische Parallelen zu einer Form der erblichen spastischen Paraparese (HSP) des Menschen, die als SPG49 klassifiziert wurde. Histologisch wird innerhalb des Rückenmarks bei Patienten mit HSP häufig in den absteigenden Nervenbahnen des Rückenmarks eine Degeneration distaler Axone festgestellt. Interessanterweise stellte sich die kanine, TECPR2-assoziierte NAD durch Neuronenverluste und axonale Sphäroide in aufsteigenden, sensorischen Faserzügen dar. Ähnliche histologische Befunde wurden bei Fällen von NAD beim Menschen nachgewiesen, deren genetische Ursache unbekannt ist. Folglich wurde anhand der NAD des Spanischen Wasserhundes und durch Charakterisierung der kausalen Mutation ein potentielles Kandidatengen für die NAD des Menschen identifiziert. TECPR2 stellt ein Autophagie-assoziiertes Protein dar, dessen Funktion bisher weitgehend unbekannt ist. Die weitere in vitro Charakterisierung von Dosalwurzelganglienkulturen von betroffenen Hunden und Kontrolltieren stellt daher ein äußerst interessantes System dar, welches die weitere funktionelle Charakterisierung des TECPR2-Proteins ermöglichen wird.

Zusammenfassend belegen die Ergebnisse dieser Studie, dass Beeinträchtigungen der Autophagie sowie der lysosomalen Degradation einen zentralen Pathomechanismus bei der Pathogenese der Neurodegeneration darstellen, der anhand der Verwendung kaniner in vivo- und in vitro Modelle weiter untersucht werden kann.

abstract (englisch)

The relevance of the dog as a translational large animal model in neuroscience has significantly increased recently. This is related to the similar organization of the canine and human nervous system, and due to parallels in the genome structure. Furthermore, the identification of canine models for human diseases is enabled by the targeted genetic analysis of human disease-associated genes in dogs, displaying a similar clinical and histologic phenotype. Moreover the genetic characterization of neurodegenerative diseases in dogs can identify genes and pathways relevant to corresponding diseases in humans with unknown background. The lysosomal storage disorder GM1-ganglioidosis, was first described in humans. The identification of the canine counterpart revealed numerous parallels in the molecular pathogenesis and neuropathology to the human disease. Interestingly, GM1-gangliosidosis and numerous other inherited neurodegenerative conditions affect dorsal root ganglia (DRG) neurons. Cell cultures of rodent or chicken DRGs have been widely used to study the pathogenesis of neurodegenerative processes and its modulation by glia cells and/or growth factors. Therefore the aims of the present study were (i) the establishment of a canine DRG culture system and the evaluation of the modulatory effects of GM1-ganglioside (GM1) on neurons and glial cells and (ii) the clinical, genetic and pathological characterization of an undescribed, inherited, neuroaxonal dystrophy (NAD) in Spanish water dogs.

The establishment of a protocol suitable for the isolation and culture of adult canine DRG neurons might provide an interesting in vitro model to study the pathogenesis of inherited neurodegenerative diseases. A corresponding protocol was successfully established, optimized, and used to characterize the impact of GM1 and/or the neurotrophins nerve growth factor (NGF) and fibroblast growth factor (FGF) 2 on neurons and glial cells. GM1 represents an important structural and functional component of intracellular membranes and is especially found in high concentrations in neuronal cell membranes and the myelin. Impairments of lysosomal GM1-degradation represent the initial pathomechanism of the lysosomal storage disorder GM1-gangliosidosis. Furthermore, age-associated changes in GM1-metabolism were suggested to play a role in synaptic and myelin pathology of neurodegenerative conditions. These cell culture experiments revealed a GM1- and NGF mediated increase in neurite outgrowth, which was associated with accumulations of synaptophysin and dynein in neuronal processes. This indicates that GM1 has an impact on synapse formation and the retrograde axonal transport. Moreover, GM1 and NGF increased the percentage of glutamine synthetase-positive non-neuronal cells in adult canine DRG cell cultures. Consequently, GM1 and NGF might affect extracellular glutamate levels, thus influencing the formation of ectopic neurites in GM1-gangliosidosis. The percentage of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive cells was increased in cultures supplemented with FGF2 compared to incubation with GM1/FGF2. Thus, FGF2 seems to favor astrocytic differentiation of glial cells, which might be inhibited by GM1. This might be pivotal to modulate astrogliosis and glial scar formation. Nevertheless, the relevance of these results in human and canine neurodegeneration has to be confirmed in further studies.

The second part of the study implied the clinical, genetic and pathological characterization of an inherited NAD in Spanish water dogs to evaluate the relevance of this breed-specific disease as a translational model for human NAD. Genetic analysis revealed a mutation in the tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 (TECPR2) gene as a highly likely cause for NAD in Spanish water dogs. This type of canine NAD displays clinical and etiologic parallels to one form of recessive inherited human hereditary spastic paraparesis designated as SPG49. Distal axon degeneration of descending motor tracts of the spinal cord is often reported in postmortem examinations of HSP patients. Interestingly, the spinal cord histology of the canine TECPR2 associated NAD was characterized by neuronal loss and axonal spheroids in the sensory pathways. This finding correlates with the histology of human NAD cases of unknown genetics. Consequently, NAD in Spanish water dogs and the characterization of the underlying mutation in TECPR2 identified a potential candidate gene for human NAD. TECPR2 represents a functionally poorly characterized protein of the autophagy pathway. The further characterization of DRG cultures of affected and control animals represents a highly interesting system to further study TECPR2 function.

Summarized, the current study provides further evidence that disturbances of the autophagosomal and lysosomal pathway represent a crucial pathomechanism in neurodegeneration that can be studied using canine cell culture and in vivo models.

keywords

Dorsalwurzelganglien, GM1-Gangliosid, Autophagie, dorsal root ganglia, GM1-ganglioside, autophagy 

kb

6.960