Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Antje Hagemann

 

Durchflusszytometrische Differenzierung boviner Leukozytenpopulationen sowie boviner maternaler Epithelzellanteile im Verlauf der Kolostralphase unter Berücksichtigung der Eutergesundheit

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103022

title (engl.)

Flow-cytometric differentiation of bovine leucocyte populations as well as bovine maternal epithelial cell ratios during the colostral phase taking udder health into consideration

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/hagemanna_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Als Kolostrum gilt die Milch, die innerhalb der ersten 3-5 Tage post partum von der Kuh produziert wird. Da die Nachfrage nach humandiätetisch supplementierenden Kolostrumprodukten zunimmt, spielt auch die Eutergesundheit von Kühen im peripartalen Zeitraum eine immer größere Rolle. Allerdings fehlen gesetzliche Angaben zu Grenzwerten bezüglich der Milchinhaltsstoffe, der zytobakteriologischen Qualität und der Rückstände. In der Literatur sind nur sehr wenige Angaben zur Zellzusammensetzung und den Veränderungsprozessen im Verlauf der Kolostralphase zu finden. Der Zellgehalt als diagnostisches Kriterium zur Beurteilung der Eutergesundheit wird aufgrund der physiologischen Erhöhung in Kolostrum kontrovers diskutiert. In Studien über reife Milch konnte gezeigt werden, dass zusätzlich zu den klassischen Eutergesundheitsparametern (Zellgehalt, Bakteriologie, NAGase-Aktivität) erstellte Differentialzellbilder eine verbesserte Beurteilung der Eutergesundheit ermöglichen.

Ziel dieser Studie war daher einerseits, die Anwendbarkeit routinemäßig für reife Milch angewandte Methoden zur Bestimmung der Eutergesundheit auch für die Kolostralmilchphase zu überprüfen. Zudem sollten mikroskopische und durchflusszytometrische Methoden zur Differenzierung somatischer Zellen aus Kolostrum erarbeitet werden. Ein besonderes Ziel lag dabei auf der eindeutigen Unterscheidung von Makrophagen und Epithelzellen.

Zu diesem Zweck wurden von Februar bis April 2011 insgesamt 306 Viertelgemelksproben von 13 Kühen aus drei landwirtschaftlichen Milchviehbetrieben in der Region Hannover gewonnen. Die Beprobung erfolgte von Tag 1 bis Tag 5 post partum und endete mit einer weiteren Probennahme an Tag 10 post partum.

Die Bestimmung des somatischen Zellgehaltes erfolgte mittels Routinemethode (Fossomatic®) und Referenzmethode (Färbung nach Prescott & Breed). Die N-acetyl-ß-D-Glucosaminidase (NAGase)-Aktivität wurde im Mikrotiterplattenverfahren bestimmt. Zusätzlich wurden die Proben auf ihren mikrobiologischen Befund untersucht. Bovine Kolostralmilchzellen wurden zunächst mit monoklonalen Antikörpern versetzt, um die für reife Milch bereits bekannte Position dieser Zellen im durchflusszytometrischen Dotplot zu bestätigen (PMN, Lymphozyten, Makrophagen), beziehungsweise neu zu erarbeiten (Epithelzellen). Im Hauptversuch wurden dann mittels Durchflusszytometrie bzw. mittels Mikroskopie (unter Herstellung von Cytospinausstrichen und der Färbung nach Pappenheim) Differentialzellbilder aus Kolostrum erstellt. Die Epithelzellen wurden sowohl mittels Membranimmunfluoreszenz (Durchflusszytometrie) als auch mittels Immunfluoreszenzmikroskopie in einem separaten Ansatz bestimmt. Morphologische Ähnlichkeiten zwischen Epithelzellen und Makrophagen schlossen eine Bestimmung beider Zellpopulationen in einem gemeinsamen Differentialzellbild aus.

Insgesamt waren 71,57 % der Proben (n = 219) bakteriologisch negativ. Proben mit bakteriologisch positivem Befund (n = 87) wiesen mit 87,36 % am häufigsten Koagulasenegative Staphylokokken (KNS) auf. Corynebacterium spp. wurden aus 3,45 %, Streptokokken aus 3,45 %, Bacillus spp. aus 1,15 % der Euterviertel isoliert. Escherichia coli wurde in einem Viertel einer Kuh über jeweils 4 Tage nachgewiesen.

Bakteriologisch positive Viertel wiesen im geometrischen Mittel mit 1,9 x 106 Zellen/ml an Kolostraltag 1 (K1) (n = 41) und 1,2 x 106 Zellen/ml an K2 (n = 34) erwartungsgemäß hohe Werte auf. In Proben aus bakteriologisch negativen Vierteln lagen mit 7,4 x 105 Zellen/ml an K1 (n = 10) und 2,6 x 105 Zellen/ml an K2 (n = 17) signifikant niedrigere Zellgehalte vor (p< 0,01). Ab K3 konnte eine Abhängigkeit des Zellgehaltes vom bakteriologischen Euterbefund nicht mehr festgestellt werden. Unabhängig vom bakteriologischen Befund nahmen die Zellgehalte bis Tag 10 post partum (5,4 x 104 Zellen/ml) ab.

Die NAGase-Aktivität scheint sich nicht für die Beurteilung der Eutergesundheit von Kühen in der Kolostralmilchphase zu eignen, da eine Abgrenzung bakteriologisch positiver von bakteriologisch negativen Vierteln nicht möglich war.

Die Zelldifferenzierung mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie ermöglichte eine genaue Bestimmung der prozentualen Anteile einzelner Zellpopulationen. Um Makrophagen von Epithelzellen unterscheiden zu können, war es jedoch notwendig, die Epithelzellen mittels eines spezifischen Antikörpers zu markieren. Hierbei kam es zu einem Vitalitätsverlust der Zellen. Die Ergebnisse standen erst nach ca. 12 h zur Verfügung.

Hohe Korrelationskoeffizienten für die Bestimmung der Anteile an PMN, Lymphozyten, Makrophagen sowie Epithelzellen (r = 0,94, 0,93, 0,96, 0,97) aus durchflusszytometrischer und mikroskopischer Zelldifferenzierung zeigen eine gute Übereinstimmung der Methoden. Die prozentualen Leukozytenanteile aus Vierteln mit negativem bakteriologischen Befund wiesen durchflusszytometrisch ermittelt am ersten Kolostraltag (K1) 43,14 ± 20,98 % für PMN, 4,58 ± 4,1 % für Lymphozyten, 37,78 ± 25,23 % für Makrophagen sowie 14,47 ± 7,55 % für Epithelzellen auf. An Kolostraltag 5 sanken die Anteile an PMN und Epithelzellen auf 22,55 ± 14,41 % bzw. 3,49 ± 1,8 % ab. Die Anteile an Makrophagen und Lymphozyten stiegen hingegen auf 55,04 ± 15,12 % bzw. 19,2 ± 7,65 % an. Tendenziell wiesen Proben aus bakteriologisch positiven Eutervierteln unabhängig von der angewandten Methode höhere Anteile an PMN (p < 0,01) sowie niedrigere Anteile an Makrophagen (p < 0,05) und Lymphozyten auf.

Die bislang für reife Kuhmilch beschriebenen Schnellmethoden sind nicht für Kolostrum geeignet, da der Einsatz eines DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffes (AO) notwendig war. Die Anteile an Epithelzellen in Kolostrum liegen deutlich höher als in reifer Milch, daher dürfen sie insbesondere an den ersten beiden Kolostraltagen nicht vernachlässigt werden. Zur genauen Bestimmung dieser Zellpopulation ist der Einsatz zeit- und laborintensiver Methoden notwendig.

Die Anwendbarkeit der klassischen Eutergesundheitsparameter muss aufgrund der gewonnenen Ergebnisse als kritisch betrachtet werden. Routinemäßig für reife Milch genutzte Methoden sollten nicht ungeprüft für Kolostrum übernommen werden.

Die erarbeiteten beziehungsweise modifizierten Methoden zur Zelldifferenzierung ermöglichen eine genaue Bestimmung der wichtigsten Zellpopulationen (PMN, Lymphozyten, Makrophagen und Epithelzellen) in Kolostrum. Die Untersuchung größerer Stichprobenumfänge könnte unter Nutzung der beschriebenen Methoden zu neuen Erkenntnissen bezüglich der komplexen Beurteilung des Eutergesundheitsstatus während der Kolostralmilchphase führen

 

abstract (englisch)

Colostrum is the milk being produced by the cow within the first 3-5 days post partum. As the demand for human dietary supplementary colostrum products increases the importance of udder health of cows in the peripartal phase is playing an increasingly important role. However, information on legal limits concerning milk content, the cytobacterial quality and residues is not available. There are only few statements to be found in literature on cell composition and transformation processes during the colostral phase. Cell content as diagnostic criterion for evaluation of the udder health is being controversially discussed due to the physiological increase in colostrum. In studies on mature milk it could be shown that, in addition to the classical parameters of udder health (cell content, bacteriology, NAGase-activity,) compiled differential cell images allowed a much better evaluation of udder health.

Thus the aim of this study was on the one hand to evaluate the applicability of routine methods for mature milk being used to determine udder health also for the colostral milk phase. Furthermore, the aim was to determine microscopic and flow-cytometric methods for the differentiation of somatic cells from the colostrum. The specific aim was to show the definite distinction between macrophages and epithelial cells.

For this purpose a total of 306 quarter milk samples of 13 cows have been taken from February to April 2011 in three different agricultural dairy farms in the region of Hannover, Germany. The sampling was done from day 1 to day 5 post partum and ended with a final sample on day 10 post partum.

Determination of the somatic cell content was done via routine method (Fossomatic®) and reference method (colouring acc. to Prescott & Breed). The N-acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAGase)-activity was determined via microtiter plates. Additionally the samples were tested for their microbiological content. Monoclonal antibodies were first added to the bovine colostrum milk cells to confirm the position of these cells, which is known for mature milk, in the flow-cytometric dot plot (PMN, lymphocytes, macrophage) and respectively determine it (epithelial cells). In the main experiment differential cell images of colostrum were created via flow-cytometry or microscopy (via production of cytosine smear and colourisation acc. to Pappenheim). The epithelial cells were determined in a separate approach by membrane immunofluorescence (flow-cytometry) as well as via immunofluorescence microscopy. Morphologic similarities between epithelial cells and macrophage prevented a joint determination of both cell populations in a single differential cell image.

In total 71.57 % of the samples (n=219) were bacteriologically negative. Samples with bacteriologically positive findings (n=87) contained, most frequently, with 87.36 %, coagulase-negative staphylococci (CNS). Corynebacterium spp. were isolated from 3.45 %, streptococci from 3.45 %, Bacillus spp. from 1,15 % of the udder quarters. Escherichia coli were found in one quarter of a cow over four days each.

Bacteriologically positive quarters showed the expected high values in geometric mean with 1.9 x 106 cells/ml at colostralday 1 (K1) (n=41) and 1.2 x 106 cells/ml at K2 (n=34). Probes of bacteriologically negative quarters showed significantly lower cell content (p<0.01) with 7.4 x 105 cells/ml at K1 (n=10) and 2.6 x 105 cells/ml at K2 (n=17). From K3 on a correlation of cell content with bacteriological findings could not be determined. Independent from bacteriological findings the cell content decreased until day 10 post partum (5.4 x 104 cells/ml).

The NAGase activity does not seem to be the appropriate parameter for the evaluation of udder health of cows in the colostral phase because a differentiation of bacteriologically positive from bacteriologically negative quarters was not possible.

The differentiation of cells via flow cytometry and microscopy allowed a distinctive identification of the percentage of single cell populations. To be able to distinguish macrophage from epithelial cells it was necessary to mark the epithelial cells with a specific antibody. This resulted in a loss of vitality of the cells. For this reason the results were only available after 12 hours.

The high correlation coefficients for the determination of ratios of PMN, lymphocytes, macrophage and epithelial cells (r = 0.94; 0.93; 0.96; 0.97) of flow cytometric and microscopic cell differentiation show that both methods are compliant. The percentage of leucocytes from quarters with negative findings showed on the first day of colostrum (K1) 43.14 ± 20.98 % for PMN, 4.58 ± 4.1% for lymphocytes, 37.78 ± 25.23 % for macrophages as well as 14.47 ± 7.55 % for epithelial cells. On day 5 of colostrum the percentages of PMN and epithelial cells decreased to 22.55 ± 14.41 % resp. 3.49 ± 1.8 %. The percentages of macrophage and lymphocytes instead increased to 55.04 ± 15.12 % resp. 19.2 ± 7.65 %. The samples from bacteriologically positive udder quarters showed by trend, independently from the method applied, higher percentages of PMN (p<0.01) as well as lower percentages of macrophages (p<0.05) and lymphocytes.

The rapid tests for mature cow milk described so far are not applicable for colostrum as the use of a DNA-specific fluorescent colorant (Acridinorange) was necessary. The ratio of epithelial cells in colostrum is significantly higher as in mature milk. For this reason they should not be neglected especially within the first two days of the colostral phase. To determine these cell populations the application of time- and laboratory intensive methods is necessary.

The applicability of the classic parameters of udder health has to be taken into critical consideration due to these findings. The methods used routinely for mature milk should not be used for colostrum without further examination.

The acquired or modified methods for cell differentiation allow the precise determination of the most relevant cell populations (PMN, lymphocytes, macrophages and epithelial cells) in colostrum. The analysis of larger samples could provide new insight on the complex determination of the udder health status during the colostral phase by using the previously described methods.

 

keywords

Durchflusszytometrie, Leukozyten, Kolostralphase; flow cytometry, leucocyte, colostral phase

kb

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