Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Andre Habierski

Die in vitro-Modifikation des kaninen ß-Galaktosidase-Gens mittels Zinkfingernukleasen und transcription activator like effector nucleases

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105508

title (engl.)

The in vitro modification of the canine ß-galactosidase gene by zinc finger nucleases and transcription activator like effector nucleases

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/habierskia_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Die GM1-Gangliosidose des Alaskan Husky ist eine autosomal–rezessiv vererbte Speicherkrankheit aus der Gruppe der Sphingolipidosen. Sie beruht auf einer 19 Basenpaar langen Duplikation innerhalb des Exon 15 des β-Galaktosidase-Gens (GLB1) mit konsekutiver Enzymdefizienz. Daraus resultieren Störungen im katabolen Stoffwechselweg der Ganglioside. Diese reichern sich vorwiegend in Lysosomen von post-mitotischen Nervenzellen an. Klinisch manifestiert sich die intraneuronale Gangliosidakkumulation insbesondere in Form von zentralnervösen Symptomen. Anhand verschiedener Studien wurde gezeigt, dass die GM1-Gangliosidose des Alaskan Husky als Modell der spät-infantilen GM1-Gangliosidose des Menschen anzusehen ist. Bisher stehen keine effizienten Therapiemethoden zur Behandlung der GM1-Gangliosidose zur Verfügung. Daher wurde im Rahmen der durchgeführten Studie die Effizienz eines Zinkfingernukleasen (ZFNs) bzw. transcription activator like effector nucleases (TALENs)–basierten, gentherapeutischen Ansatzes zur Wiederherstellung des Wildtyp GLB1-Genes in vitro evaluiert.

Zu diesem Zweck wurden spezifische ZFNs und TALENs hergestellt, deren DNS-Bindungsstelle in unmittelbarer Nähe des mutierten, kaninen GLB1-Lokus liegt. Um die mutierte GLB1-Sequenz zu reparieren bzw. den Gendefekt mit der 19 bp Duplikation in kaninen Wildtyp-Fibroblasten zu induzieren, wurden entsprechende Reparaturkassetten generiert. Im Rahmen der durchgeführten Experimente erfolgte die Transfektion von Wildtyp-Fibroblasten sowie von einem Alaskan Husky stammenden GLB1 defizienten Fibroblasten mit den ZFN- sowie TALEN enkodierenden Plasmiden. Die Transkription der ZFNs wurde mittels PCR nachgewiesen. Außerdem wurde zum Nachweis der ZFNs- bzw. TALENs-Expression und zellulären Lokalisation eine Immunfluoreszenz durchgeführt. Des Weiteren erfolgte zur Detektion der ZFNs- bzw. TALENs-vermittelten Induktion eines Doppelstrangbruches (DSB) am Targetlokus ein T7-Assay. Um eine ZFNs-vermittelte Modifikation des GLB1 Exon 15 in Wildtyp- bzw. GLB1 defizienten Fibroblasten nachzuweisen, wurden diese Zellen mit den verschiedenen ZFN-Vektoren sowie der entsprechenden Reparaturkassette transfiziert. Nach DNS-Isolierung erfolgte eine Detektion der GLB1 Exon 15 Modifikation mittels PCR und anschließender nested-PCR.

Die Transkription der ZFNs wurde erfolgreich nachgewiesen. In der Immunfluoreszenz stellte sich eine zytoplasmatische Akkumulation der ZFN1 dar, während die ZFN2 überwiegend im Kern nachgewiesen wurde. Die TALEN-Proteine wurden sowohl intrazytoplasmatisch als auch nukleär detektiert. Außerdem war mittels T7-Assay kein ZFNs-vermittelter DSB bzw. keine ZFNs-modulierte Genmodifikation des kaninen GLB1 Exon 15 detektierbar. Demgegenüber zeigten die TALEN-Proteine eine DSB Induktion am Ziellokus.

Um die ZFNs bzw. TALENs sowie die repair template Sequenzen in die Zielzellen zu transportieren, wurde ein virales Vektorsystem etabliert. Die Herstellung der HIV-basierten, integrierenden sowie Integrase-defizienten, lentiviralen Vektoren erfolgte unter Verwendung von human embyonic kidney (HEK) Zellen, welche mittels Kalziumphosphat-Präzipitation transfiziert wurden. Zur Generierung eines lentiviralen Vektors mit erhöhtem Neurotropismus wurde zur Pseudotypisierung neben dem Glykoprotein des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) auch das Tollwut Virus Glykoprotein (Rab-G) verwendet. Die Evaluierung der Transduktionseffizienz erfolgte anhand von kaninen Wildtyp- und GLB1 defizienten Fibroblasten sowie mittels muriner und kaniner Neurone aus dem Dorsalwurzelganglion.

Es wurden erfolgreich integrierende sowie Integrase-defiziente, VSV-G bzw. Rab-G pseudotypisierte Lentiviren hergestellt. Allerdings wiesen Rab-G pseudotypisierte Viren deutlich niedrigere Titer im Vergleich zu VSV-G pseudotypisierten Viren auf. Die Transduktion von kaninen Wildtyp- bzw. GLB1 defizienten Fibroblasten war unter Verwendung der hergestellten Lentiviren möglich. VSV-G pseudotypisierte, integrierende Lentiviren wiesen eine Transduktionseffizienz von ca. 90 % der Zellen auf, während mit Rab-G-pseudotypisierten Lentiviren lediglich ca. 40 % der Fibroblasten transduziert wurden, dies resultiert höchstwahrscheinlich aus den Differenzen im Virustiter der Rab-G pseudotypisierten im Vergleich zu den VSV-G Lentiviren. In kaninen und murinen Neuronen wurde lediglich die durch integrierende und Integrasedefiziente Lentiviren induzierte Transgenexpression nachgewiesen.

Im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit dem Transgenic Models of Diseases & Transgenic Unit Institute of Molecular Genetics of the ASCR (Prag, Tschechische Republik) erfolgte die Herstellung eines transgenen Mausmodells, in dem das murine Glb1 Exon 15 durch die Insertion einer kaninen, mutierten GLB1 Exon 15 Kassette zerrissen wurde. Im Rahmen der durchgeführten Studie wurde die Genotypisierung dieser Mäuse etabliert und bei 3 von 35 Mäusen die erfolgreiche Insertion der transgenen Kassette nachgewiesen.

Auf Grund der Ergebnisse der durchgeführten Studie ist davon auszugehen, dass die Funktionalität der hergestellten ZFNs im genomischen Kontext nicht gegeben ist. Dies kann auf der Herstellung der ZFNs durch modular assembly, auf die DNS-Struktur des genomischen ZFNs Targetlokus, die fehlerhafte Modifikation eines einzelnen Fingers im Bereich des Zinkfinger2 des ZFN2-Moleküls zur Erhöhung der Bindungsspezifität sowie die zytoplasmatisch akzentuierte Akkumulation der HA-getaggten ZFN1 oder auf die Abhängigkeit der Aktivität von ZFNs von der transfizierten Plasmidmenge zurückzuführen sein.

Die TALEN-Proteine ermöglichen eine DSB-Induktion am Targetlokus. Daher ist die Herstellung eines lentiviralen Vektors, der sowohl beide TALENs enkodiert als auch die Reparatursequenz außerhalb des offenen Leserahmens beinhaltet, als mögliches System anzusehen, das die erfolgreiche Modifikation des kaninen GLB-Genes ermöglicht. Die Effizienz der TALEN-basierten Gentherapie soll im Rahmen folgender Studien unter Verwendung der hergestellten Glb1 em1/RASE-/-Tg(can GLB1mut)-Mäuse bzw. deren Gewebe in vitro und in vivo evaluiert werden.

 

abstract (englisch)

The GM1-gangliosidosis of the Alaskan Husky is a rare autosomal recessive storage disease of the group of sphingolipidoses. It is based on a 19 base pair duplication in exon 15 of the β-galactosidase gene (GLB1) with consecutive enzyme deficiency. This results in disturbances of catabolic pathways of gangliosides which accumulate mainly in lysosomes of post-mitotic neurons. Clinically, intra-neuronal ganglioside accumulations manifest mainly in form of central nervous signs. Based on previous studies, the GM1-gangliosidosis of the Alaskan Husky was found to be a useful model of late infantile GM1-gangliosidosis in humans. To date, no effective treatment approaches are available. Therefore, the efficiency of a zinc finger nucleases (ZFNs)- or transcription activator like effector nucleases (TALENs)-based gene therapy approach to restore the wild-type GLB1 gene in vitro was evaluated in the present study.

Specific ZFNs and TALENs were prepared with DNA binding sites located in close proximity to the mutated canine GLB-locus. To repair the mutant GLB1-sequence or to induce the gene defect with the 19 bp duplication in wild-type cells, corresponding repair cassettes were generated. Transfection of wild-type fibroblasts as well as Alaskan Husky derived GLB1 deficient fibroblasts with ZFN- and TALEN-encoding plasmids was carried out with subsequent detection of ZFNs transcription by PCR. In addition, ZFNs- and TALENs-expression as well as their cellular localization was determined by immunofluorescence. Furthermore, for detection of ZFN- or TALEN-mediated induction of a double-strand break (DSB) at the target locus, a T7-assay was carried out. To detect a ZFN-mediated modification of the GLB1 exon 15 in wild-type- and GLB1 deficient fibroblasts, cells were transfected with different ZFNs-vectors and respective repair cassettes. After DNA-isolation, modification of the GLB1 exon 15 was detected by PCR and subsequent nested-PCR. Transcription of ZFNs was successfully verified and cytoplasmic accumulation of ZFN1 in contrast to ZFN2 which was predominantly detected in the nucleus was detected by immunofluorescence. TALEN proteins were detected intracytoplasmic and in the nucleus. Additionally, no ZFN-mediated DSB or ZFN-modulated gene modification of canine GLB1 exon 15 was detected by T7-assay. In contrast, TALEN-proteins showed DSB-induction at the target locus. To transport ZFNs or TALENs and the repair template-sequences in the target cells, a viral vector system was established. Preparation of HIV-based as well as integrating or integrase-deficient lentiviral vectors was carried out using human embryonic kidney (HEK) cells transfected by calcium-phosphate-precipitation. To generate a lentiviral vector with increased neurotropism, in addition to the glycoprotein of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) pseudotyping, the rabies virus glycoprotein (Rab-G) pseudotyping was used. Evaluation of transduction efficiency was carried out using canine wild-type and GLB1 deficient fibroblasts as well as murine and canine dorsal root ganglia neurons. The development of integrating and integrase-deficient VSV-G- or Rab-G-pseudotyped lentiviruses was successful. However, virus titers of Rab-G-pseudotyped viruses were significantly lower compared to VSV-G-pseudotyped viruses. Transduction of canine wild-type or GLB1 deficient fibroblasts using produced lentiviruses was successful. VSV-G-pseudotyped, integrating lentiviruses showed a transduction efficiency of about 90% of cells, whereas only 40% of fibroblasts were transduced with pseudotyped lentiviruses with Rab-G. This resulted most likely from a different virus titers of Rab-G-pseudotyped lentiviruses compared to VSV-G lentiviruses. In canine and murine neurons, VSV-G-pseudotyped integrating and integrase-deficient lentivirus resulted in induced transgene expression only. As part of a cooperation project with the Transgenic Models of Diseases & Transgenic Unit Institute of Molecular Genetics of the ASCR (Prague, Czech Republic) a transgenic mouse model with disrupted murine Glb1 exon 15 by the insertion of a canine mutant GLB1 exon 15 cassette was produced. Genotyping of these mice was established and detection of inserted transgenic cassettes in 3 of 35 mice was successful.

Based on the obtained results, it may be concluded that functionality of the produced ZFNs is not given in the genomic context. This could be based on the production of ZFNs by modular assembly, the DNA structure of the genomic ZFN target locus, an incorrect modification of a single finger in the area of zinc finger2 of the ZFN2 molecule to increase binding specificity as well as on the mainly cytoplasmic accumulation of HA-tagged ZFN1 or dependence of the activity of ZFNs caused by the amount of transfected plasmid.

TALEN-proteins enable DSB-induction at the target locus. Therefore, the preparation of a lentiviral vector containing both TALENS sequences and included repair sequences outside the open reading frame could be a possible system that allows successful modification of the canine GLB1 gene. The efficiency of the TALEN-based gene therapy needs to be evaluated in further studies using the produced Glb1 em1/RASE-/-Tg (can GLB1mut)-mice or their tissues in vitro and in vivo.

 

keywords

GM1-Gangliosidose, Zinkfingernukleasen, rekombinante Lentiviren, GM1-gangliosidosis, zinc finger nucleases, recombinant lentiviruses 

kb

7.636