Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Melanie Haas

Evaluation of the behavior and clinical utility of serum CXCL8 (Interleukin-8) in canine pyometra and tumor bearing dogs

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107259

title (engl.)

Untersuchungen zur Analytik und zum klinischen Nutzen von Serum CXCL8 (Interleukin-8) bei Hunden mit Pyometra und neoplastischen Erkrankungen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/haasm_ws15.pdf

abstract (deutsch)

CXCL8 ist ein pro-inflammatorisches und angiogenetisches Chemokin, welches von einer Vielzahl von Zellen, inklusive Tumorzellen, sezerniert werden kann. Ein CXCL8-Anstieg wurde bereits bei vielen entzündlichen und tumorösen Erkrankungen beim Mensch und einigen Tierarten nachgewiesen und wird deshalb als potenzielles diagnostisches, prognostisches und therapeutisches Hilfsmittel anerkannt. Beim Hund gibt es nur wenige Untersuchungen zu zirkulierendem CXCL8.

Ziele dieser Dissertation waren die Analyse von möglichen krankheitsabhängigen unterschiede der CXCL8-Konzentrationen und die Untersuchung von Zusammenhängen zwischen Serum-CXCL8 und krankheitsspezifischen Merkmalen bei Hunden mit Pyometra und unterschiedlichen Neoplasien. Zusätzlich sollte das Verhalten von Serum-CXCL8 in Bezug auf gängige Labor-Entzündungsparameter, wie die Leukozyten-, Neutrophilen- und CRP-Werten, determiniert werden.

Serum-CXCL8 wurde einmalig vor Therapiebeginn, bei einer Gesamtzahl von 158 Hunden mit Neoplasien, Allergien, Pankreatitiden, entzündeten Wunden, Angiogenese-assoziierten Prozessen, Anämien, Pyometren, Nieren-, Leber-, Lungen-, und orthopädischen Erkrankungen untersucht. 23 Hündinnen mit unterschiedlichem Schweregrad einer Pyometra und 66 Hunde mit diversen Neoplasien wurden einmalig auf Serum-CXCL8 beprobt um weiterführende Untersuchungen innerhalb dieser Prozesse durchzuführen. 23 klinisch gesunde Hunde dienten als Kontrollgruppe für die Untersuchungen bei Hunden mit Tumorerkrankungen. Für die vergleichende Analyse der unterschiedlichen Erkrankungen und für die Hündinnen mit Pyometra wurden 12 weitere gesunde Hunde in die Kontrollgruppe mit einbezogen. Zusätzlich wurden anhand dieser letzten Kontrollgruppe Einflüsse des Alters, Geschlechts und Kastrationsstatus auf die Serum-CXCL8 Konzentrationen ausgeschlossen.

Die quantitative Bestimmung von zirkulierendem CXCL8 im Serum wurde anhand eines kommerziell erhältlichen caninen ELISA (Fa. R&D Systems, Minneapolis) durchgeführt, welcher die 74 und 79 Aminosäuren-Sequenzen des natürlichen und rekombinanten caninen CXCL8 erkennt. Die Leukozyten- und Neutrophilenzahlen wurden anhand eines CellDyn 3500 automatisierten Hämatologie-Analysegerätes aus Vollblutproben bestimmt. CRP wurde im Serum, mit einem Konelab 20i automatisierten Biochemie-Analysegerät und die entsprechenden kommerziell erhältlichen Kits für die klinische Chemie, gemessen. Für jeden Studienabschnitt wurden die Patienten in Bezug auf spezifische Erkrankungsmerkmale und Labor-Entzündungsparameter in Gruppen unterteilt und mit Hilfe von deskriptiver Statistik, Mann-Whitney-U-Test, ROC und GLM analysiert.

Alle untersuchten Erkrankungen zeigten höhere Serum-CXCL8 Medianwerte als die Gesundproben und waren somit meistens signifikant höher als bei der gesunden Kontrollgruppe (1020 pg/ml). Von allen erkrankten Patienten hatten die Anämie-Patienten die höchsten Serum-CXCL8 Werte (Median = 17960 pg/ml) und diese waren oft auch in Bezug auf die anderen Erkrankungen signifikant erhöht (p < 0,05). Hunde, die aufgrund der untersuchten Erkrankungen verstarben, wiesen deutlich höhere Serum-CXCL8 Werte auf, als genesene Hunde (p = 0,039). Da kein signifikanter Unterschied zwischen den Serum-CXCL8 Konzentrationen bei diversen Erkrankungen festgestellt werden konnte, ist die Diagnose einer spezifischen Erkrankung anhand dieses Chemokins nicht möglich.

Hinsichtlich der Laborparameter war Serum-CXCL8 bei Leukopenie, Neutropenie und normalem CRP am höchsten, während bei einem hochgradigen Leukozyten-, Neutrophilen- und CRP Anstieg keine CXCL8 Erhöhung festgestellt wurde. Diese Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant. Abgesehen von den Entzündungsparametern wurde ein Zusammenhang zwischen dem Hämatokrit und Serum-CXCL8 festgestellt. Hier zeigten Patienten mit einem niedrigen Hämatokrit signifikant hohe Serum CXCL8 Werte (mittelgradig: p = 0,006 und hochgradig: p = 0,001). Aufgrund der geringen Gruppengröße konnten leider keine weiterführenden Untersuchungen in dieser Hinsicht durchgeführt werden. Jedoch bieten diese Befunde einen Anlass für zukünftige Studien.

Bei der Untersuchung von Hündinnen mit Pyometra zeigten diese signifikant höhere Serum-CXCL8 Werte als gesunde Hunde (p = 0,026). Jedoch hatten nur Hunde mit milder Symptomatik und einer mittelgradigen Uterusfüllung deutlich erhöhte Serum-CXCL8-Konzentrationen (jeweils p = 0,002 und p = 0,03), während Hunde mit hochgradiger Pyometra und schwerwiegender Symptomatik nicht von den gesunden Hunden unterschieden werden konnten. Die Untersuchung der Entzündungsparameter in der Pyometra-Gruppe ergab ähnliche Ergebnisse wie bei der Untersuchung der anderen Erkrankungen. Serum-CXCL8 war bei moderater Neutrophilie (p = 0,001) und normalen CRP-Werten (p < 0,001) signifikant erhöht, während bei einem hochgradigen Neutrophilen- und CRP-Anstieg keine erhöhten Serum-CXCL8-Konzentrationen nachgewiesen wurden. Obwohl Serum-CXCL8 das Ausmaß einer Pyometra teilweise wiederspiegelt, ist unklar, ob die Serum-CXCL8 Schwankungen die Ursache, oder eine Folge der Erkrankung sind.

Hunde mit Tumoren zeigten signifikant höhere Serum-CXCL8-Konzentrationen im Vergleich zu gesunden Hunden (p < 0,001). Zusätzlich waren die Werte bei Hunden mit Tumoren über 4 cm Größe signifikant höher als bei Tumoren unter 2 cm (p = 0,04). Obwohl kein signifikanter Unterschied zwischen Serum-CXCL8 und den unterschiedlichen Malignitätsgruppen nachgewiesen werden konnte, gab es eine Tendenz zu niedrigeren CXCL8-Werten bei höherer Malignität. Hunde mit benignen Tumoren hatten den höchsten Serum-CXCL8-Medianwert und dieser war signifikant höher als bei der Kontrollgruppe (p = 0,007). Dagegen konnten Patienten mit hochmalignen Tumoren nicht von gesunden Hunden unterschieden werden. Weitere Tumoreigenschaften, wie die Tumorart, das Ausgangsgewebe, die Tumorvaskularisation, die Tumornekrose und die Tumor infiltrierenden Zellen, konnten anhand von Serum-CXCL8-Konzentrationen nicht festgelegt werden. Diese Analyse bestätigt, dass neoplastische Erkrankungen beim Hund mit einer Erhöhung von Serum-CXCL8 einhergehen und, dass diese hauptsächlich mit der Tumorgröße in Verbindung steht. Obwohl anhand der Ergebnisse ein Zusammenhang zur Tumormalignität vermutet wird, muss dies durch weitere Studien belegt werden.

Die Ergebnisse dieser Studie lassen darauf schließen, dass Serum-CXCL8 ein unspezifischer Entzündungsparameter ist, der sowohl bei diversen inflammatorischen, wie auch neoplastischen Prozessen erhöht ist. Der Zusammenhang zwischen Serum-CXCL8-Konzentrationen und bestimmten Erkrankungsmerkmalen lässt eine Beteiligung dieses Chemokins in der Pathogenese von verschiedenen Erkrankungen vermuten, jedoch bleiben das Ausmaß und die genauen Mechanismen ungeklärt. Aufgrund der gut messbaren Serum-CXCL8 Schwankungen und der kurzen Halbwertszeit könnte CXCL8 von klinischem Nutzen sein, um den Verlauf und Schweregrad von Erkrankungen einzuschätzen. Allerdings sind weitere Untersuchungen erforderlich, um genaue Referenzwerte festzulegen und CXCL8 als standardisierten Laborparameter etablieren zu können.

Ergebnisse dieser Studie sind in zwei zur Veröffentlichung angenommenen Publikationen dokumentiert.

abstract (englisch)

CXCL8 is a pro-inflammatory and angiogenic chemokine that is produced by multiple cell types in response to diverse stimuli. Its local and systemic increase has been found in several inflammatory and neoplastic diseases in humans and some animal species and is therefore considered a potential diagnostic and prognostic marker, as well as a possible therapeutic tool. Yet, research into circulating CXCL8 in dogs is limited.

The initial aim of this dissertation was to determine possible differences of serum CXCL8 values among dogs with commonly occurring diseases and herewith detect possible CXCL8-linked processes. Later on, the analysis was focused on the behavior of CXCL8 in canine pyometra and tumor bearing dogs in order to determine its association with disease characteristics and severity. Furthermore, the relation between serum CXCL8 and routine laboratory inflammation parameters such as WBC, neutrophil count and CRP values was examined.

A single point measurement of serum CXCL8 was performed in 158 dogs with neoplasias, hepatic diseases renal failure, allergies, respiratory diseases, infected wounds, orthopedic conditions, angiogenic processes, pancreatitis, pyometra and anemia. 23 dogs with different stages of pyometra and 66 dogs with diverse neoplastic diseases served for the single point measurement of serum CXCL8 within these concrete processes. 23 clinically healthy dogs were used as a control group for the evaluation of tumor bearing dogs. For the analysis of diverse diseases and canine pyometra 12 healthy dogs were additionally added. This group of 35 dogs was also used to discard an influence of age, gender and neutering status on CXCL8.

The quantitative determination of circulating serum CXCL8 was assessed through a commercially available canine ELISA-Kit that recognizes the 74 and 79 amino acid variants of natural and recombinant canine CXCL8. WBC and neutrophil counts were analyzed with a CellDyn 3500 automated hematology analyzer, whereas CRP values were determined using a Konelab 20i automated biochemical analyzer and commercial kits. For each of the studies patients were grouped according to the disease dependent features and the laboratory parameters and then analyzed through descriptive statistics, non parametric Mann-Whitney-U-Test, ROC and GLM.

All analyzed diseases had a higher serum CXCL8 median value than healthy dogs (> 1020 pg/ml), being most of them significantly different from the control group (p < 0.05). In particular, anemic patients had the highest median CXCL8 values (17 960 pg/ml) among all groups showing also a significant difference to other diseases (p < 0.05). Higher values were also associated with the patients natural death regardless of the disease, being significantly different from patients that recovered (p = 0.039). Yet, serum CXCL8 levels were not significantly different between most examined diseases, making it impossible to identify the presence of a specific disease based on the blood levels of this chemokine.

Regarding the laboratory parameters, serum CXCL8 was highest in the presence of leucopenia, neutropenia and normal CRP values and was low when leucocytosis, neutrophilia and a CRP increase were severe. The difference however was statistically not significant. It was interesting to find that low HCT values were accompanied by significantly high serum CXCL8 levels (moderate: p = 0.006 and severe: p = 0.001). Unfortunately, a more profound evaluation of these findings was not possible due to reduced group sizes, making it an interesting field for future research.

In the analysis of pyometra, dogs with this condition had significantly higher serum CXCL8 values than healthy dogs (p = 0.026). However, increased values were only observed in patients with mild symptoms (0.002) and a moderate uterine distension (p = 0.03), while severely affected patients had similar values as healthy dogs. As well as in the initial evaluation in diverse diseases, serum CXCL8 concentrations were higher in dogs with moderate neutrophilia (p = 0.001) and normal CRP levels (p < 0.001) than in dogs with severely increased values. Serum CXCL8 showed to reflect the degree of ongoing pyometra although it is unclear whether the changing CXCL8 concentrations are part of the cause or a consequence of the disease.

Serum CXCL8 was detected in significantly higher concentrations in tumor bearing dogs compared with healthy dogs (p < 0.001) and was higher in dogs with tumors larger than 4 cm than in tumors below 2 cm size (p = 0.04). Although serum CXCL8 did not differ significantly among the different degrees of malignancy, values tended to be lower with increasing malignancy. Whereas benign tumors had the highest median value and were statistically different from healthy patients (p = 0.007), highly malignant tumors were indistinguishable from the healthy group. No statistically significant correlation was found in regard to the tumor type, tissue origin and histological features such as tumor vascularization, tissue necrosis or tumor infiltrating cells. These results show that serum CXCL8 concentrations in tumor bearing dogs are mostly dependent on the tumor size rather than on the tumor type and its histological characteristics. Even though serum CXCL8 is suspected to decrease with increasing malignancy further studies are warranted to confirm this.

In conclusion, serum CXCL8 is an unspecific inflammation marker that is increased in diverse inflammatory and neoplastic diseases. The correlation of serum CXCL8 and determined disease features suggests an involvement of this chemokine in the physiopathology of various diseases but the extent and precise mechanisms remain to be clarified. Serum CXCL8 could be a useful tool for the estimation of the course and severity of diseases due to its well measureable fluctuations and short half-life. Yet, further studies are warranted to determine exact reference values and be able to establish CXCL8 as a standardized laboratory parameter.

Some of the results of this research are documented in two manuscripts accepted for publication.

keywords

Serum, CXCL8, Hunde, dogs

kb

1.412