HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Gert Zimmer

 

Die Multifunktionalität viraler Membranproteine:

Rezeptorbindung, Fusion, Virusreifung und

Freisetzung bioaktiver Peptide

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2161

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2003

text

/dissertations/h_zimmer03.pdf

Zusammenfassung

Die Membranproteine umhüllter Viren spielen bei der Infektion der Wirtszelle eine entscheidende Rolle, denn sie vermitteln die Adäsion der Viruspartikel an die zelluläre Plasmamembran und induzieren die Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran. Zudem sind sie an der Virusreifung beteiligt und spielen bei der Auseinandersetzung mit dem Immunsystem des Wirtes eine wichtige Rolle. Die viralen Membranproteine unterliegen zahlreichen co- und posttranslationalen Modifikationen, die ihre Struktur und Funktion entscheidend beeinflussen.

In dieser Arbeit wurden mehrere dieser Aspekte bei verschiedenen umhüllten RNA-Viren untersucht.

Die Hauptkomponente der Hülle des Influenza-C-Virus ist das Glykoprotein HEF, das 9-Oacetylierte Sialinsäuren als Rezeptordeterminante auf zellulären Glykoproteinen und Glykolipiden erkennt. Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Glykokonjugate selektiv von dem Virus erkannt werden. Bevorzugt werden offensichtlich muzinartige Membranproteine wie

gp36/gp40, die zahlreiche, in Clustern angeordnete O-Glykane besitzen und eine multivalente Interaktion mit den HEF-Trimeren ermöglichen. Einige Daten weisen darauf hin, dass

gp36/gp40 selektiv durch O-Acetyltransferasen modifiziert wird.

Beim Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) übernimmt das S-Protein die Funktion der Rezeptorbindung. Als zellulärer Rezeptor fungiert porzine Am inopeptidase N. Zusätzlich erkennt das S-Protein eine Sialinsäure als Rezeptordeterminante. Diese Fähigkeit steht mit dem Enterotropismus des Virus in Beziehung. Die Untersuchungen an diesem Membranprotein zeigten, dass seine sialinsäurebindende Aktivität weniger mit der

Resistenz des Proteins gegenüber Detergenzien, Proteasen und extremen pH-Werten zu tun hat, als vielmehr für eine verbesserte Bindung an die Zelloberfläche von Bedeutung ist. Unter

den zahlreichen zellulären Oberflächenproteinen wurde auch vom S-Protein nur ein einzelnes, muzinartiges Sialoglykoprotein selektiv gebunden. Eine rezeptorbindende Aktivität ist auch mit dem Fusionsprotein (F) von HRSV und BRSV assoziiert, denn rekombinante Viren mit dem F-Protein als einzigem Hüllglykoprotein erwiesen sich als infektiös. Mit Hilfe rekombinanter Viren und chimärer F-Proteine konnte nachgewiesen werden, dass allein die F2-Untereinheit für den Wirtstropismus der beiden Viren verantwortlich ist. Das G-Protein trug nicht zum Wirtstropismus bei, verbesserte aber aufgrund seiner rezeptorbindenen Eigenschaften die Infektion. Das F-Protein der respiratorischen Symzytialviren ist zahlreichen posttranslationalen Modifikationen unterworfen. Wie die Untersuchungen ergaben, enthält das reife F-Protein von HRSV drei N-Glykane, die für den intrazellulären Transport nicht notwendig sind. Als einzige Zuckerseitenkette erwies sich das N-Glykan in der Stielregion (N500) für die Fusionsaktivität des Proteins von Bedeutung. Eine weitere Modifikation ist die proteolytische Aktivierung des F-Proteins durch die zelluläre Protease Furin. Es konnte gezeigt werden, dass diese Protease die F-Proteine beider respiratorischer Synzytialviren an zwei Positionen spaltet, wobei in beiden Fällen ein glykosyliertes Peptid von 27 Aminosäuren freigesetzt wird. Die Spaltung an der Position RAK/RR109 erwies sich für die Replikation von BRSV in Zellkultur als nicht essentiell und auch das Peptid konnte ohne Auswirkung auf die Infektiosität des Virus deletiert werden. Für BRSV wurde das Schicksal des freigesetzten Peptids im Detail untersucht. Es zeigte sich, dass es noch weiteren posttranslationalen Modifikationen unterliegt und als tachykininähnliches Peptidhormon (Virokinin) in den Zellkulturüberstand sezerniert wird. Virokinin bindet und aktiviert spezifische G-gekoppelte Tachykininrezeptoren in der Plasmamembran und löst auf diese Weise unter anderem die Kontraktion glatter Muskulatur aus. Das Hundestaupevirus (CDV) und das Masernvirus sind zwei nahe verwandte Morbilliviren,

die mit dem Fusionsprotein F und dem rezeptorbindenden Protein H zwei integrale Membranproteine in ihrer Hülle besitzen. Mit Hilfe rekombinanter Viren konnte nachgewiesen werden, dass das H-Protein des einen Virus auch im genetischen Kontext des anderen Virus funktionell ist. Dabei zeigte sich, dass der Zelltropismus sowie die fusiogenen und cytopathogenen Eigenschaften weitgehend von dem transgenen H-Protein bestimmt werden. Das G-Protein des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) besitzt in seiner cytoplasmatischen Domäne ein tyrosinhaltiges Signal, dass für den basolateralen Transport des Proteins in polarisierten Epithelzellen verantwortlich ist. Es wurden rekombinante VSV-Mutanten hergestellt, deren G-Protein in polarisierten Zellen ungerichtet transportiert wurde. Diese Viren wurden weiterhin streng basolateral freigesetzt. Der apikale Anteil des G-Proteins führte also nicht zu einer apikalen Freisetzung infektiöser Viren. Somit ist das G-Protein nicht alleine für die basolaterale Virusreifung verantwortlich.

keywords

Fusionsprotein, Rezeptor, Virushülle, fusion protein, receptor, virus envelone

kb

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