HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Jörg Willenborg

 

Die Bedeutung des bakteriellen Zentralstoffwechsels

für die Wirtsadaptation und Virulenz

von Streptococcus suis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2859

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_willenborg17.pdf

Zusammenfassung

Streptococcus (S.) suis ist ein wichtiger Infektionserreger beim Schwein, der vor allem in Asien als Zoonoseerreger von steigender Bedeutung ist. Im Schwein kolonisiert S. suis vorwiegend die Schleimhäute des oberen Respirationstraktes, ohne eine Krankheitssymptomatik hervorzurufen. Allerdings kann S. suis invasive Infektionen verursachen und zu klinischen Manifestationen wie Septikämien, Endokarditiden und Meningitiden führen. Über die Pathogenese der S. suis-Infektion ist nur wenig bekannt. Die Pathogenität von S. suis wird einerseits über die Expression von Virulenzfaktoren erklärt. Andererseits scheint aber auch eine effiziente Anpassung von S. suis an unterschiedliche, im Nährstoffangebot variierende, Wirtshabitate eine wesentliche Rolle zu spielen. Zu diesen Wirtshabitaten zählen während der bakteriellen Kolonisierungsphase die Schleimhäute des oberen Respirationstraktes und während einer manifesten S. suis-Infektion das Blutkreislaufsystem und die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF). Das Ziel dieser Arbeit war es, die metabolische Adaptation von S. suis an den Wirt zu charakterisieren. Zudem sollten nähere Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie zentrale Stoffwechselprozesse reguliert werden und welche Konsequenzen ein gezieltes Eingreifen in diese metabolischen Prozesse für die Adaptation und Virulenz von S. suis haben kann. Im Einzelnen standen folgende Ziele im Mittelpunkt der Arbeiten:

  • Etablierung einer effizienten Methode zur genetischen Manipulation von S. suis für funktionelle Analysen des zentralen Metabolismus und dessen Regulation.
  • Charakterisierung der Anpassung des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels und den damit verknüpften Aminosäurebiosynthesewegen von S. suis an chemisch definierte Bedingungen und unterschiedliche Wirtsmilieus.
  • Bedeutung des Arginin-verstoffwechselnden Arginin-Deiminase-Systems (ADS) als sekundär energieliefernden Aminosäurestoffwechselweg für die metabolische Adaptation von S. suis.

Ebenso wie andere pathogene Streptokokken nutzt S. suis unterschiedlichste Kohlenhydrate für das Wachstum. Glukose ist dabei das bevorzugte Substrat und kann für die Synthese für einen Großteil der Aminosäuren genutzt werden. S. suis kann nicht alle Aminosäuren selbst de novo synthetisieren und muss diese essentiellen Aminosäuren daher über Transportersysteme aufnehmen. Isotopologue Profiling-Experimente ergaben, dass Glukose hauptsächlich über die Glykolyse, auch Embden-Meyerhof-Parnas-(EMP)-Weg genannt, und nur zu einem geringen Anteil über den Pentosephosphatweg (engl.: pentose phosphate pathway, PPP) verstoffwechselt wird. Um einen unvollständigen Tricarbonsäurezyklus zu kompensieren, wird Oxalacetat durch eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (ppc) aus Phosphoenolpyruvat synthetisiert. Die Essentialität dieser Reaktion für eine effiziente metabolische Adaptation von S. suis wurde durch eine genomische Deletion des ppc-Gens bestätigt. Isotopologue Profiling-Experimente ermöglichten zudem die Rekonstruktion der Aminosäurebiosynthesewege und ergaben, dass die Aminosäuren bei S. suis über die Stoffwechselprodukte des EMP-Weges, des PPP und der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Reaktion de novo synthetisiert werden. Isotopologue Profiling-Experimente in porzinem Blut und CSF zeigten, dass in diesen Wirtsmilieus die gleichen Stoffwechselwege aktiv sind. Allerdings scheint im CSF im Vergleich zum Blut ein höherer Bedarf an aromatischen und verzweigtkettigen Aminosäuren zu sein. Gestützt wurden diese Erkenntnisse durch eine durchschnittlich niedrigere Aminosäurekonzentration im CSF im Vergleich zu porzinem Serum und die in genomweiten Transkriptomanalysen detektierte Aufregulation mehrerer Gene, die an der Biosynthese von diesen Aminosäuren beteiligt sind. Im Blut scheint die Aufnahme und Verstoffwechselung alternativer Kohlenhydrate, so wie der PPP und eine davon abgeleitete Nukleotidbiosynthese von Bedeutung zu sein, wie Transkriptomanalysen andeuteten.

Ein wichtiger Faktor für die Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels, aber auch für die Virulenz von S. suis, ist CcpA. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CcpA ein Glukose-abhängiger, globaler Regulator von metabolischen und Virulenz-assoziierten Genen ist. Er reguliert dabei hochspezifisch, über die Erkennung konservierter DNA-Motive in den regulatorischen Bereichen CcpA-abhängiger Gene. CcpA kontrolliert unter anderem die Expression des bedeutendsten Virulenzfaktors von S. suis, der Polysaccharidkapsel. Dieser Einfluss ist vermutlich ursächlich für eine verringerte Virulenz eines CcpA-defizienten Stammes.

Neben dem zentralen Kohlenhydratmetabolismus kann auch die Verstoffwechselung von Aminosäuren Energie erzeugen. Ein Beispiel hierfür ist der Abbau von Arginin durch das ADS von S. suis. Die Information für die enzymatische Aktivität dieses Stoffwechselweges liegt auf dem arcABC-Operon. Durch die Genprodukte des arcABC-Operons wird Arginin unter der Bildung von Ornithin zu Ammonium und Kohlendioxid verstoffwechselt, wobei Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) entsteht. Die hier angeführten Arbeiten zeigten, dass das ADS von S. suis wichtig für das intrazelluläre Überleben in eukaryotischen Zellen ist, indem es Ammonium-Ionen und ATP zur Neutralisierung des pH-Wertes des Endosoms liefert. Die Bedeutung dieses Prozesses für S. suis zeigt sich dadurch, dass der Argininimport über den ADS-assoziierten Arginin-Ornithin-Antiporter ArcD, trotz des Vorhandenseins weiterer Arginin-Transporter in S. suis, wichtig für die Funktionalität des ADS ist. Die Arbeiten zur Regulation des ADS weisen im Weiteren auf eine besondere Rolle des ADS für S. suis hin. Das arcABC-Operon wird durch physiologische Signale und dazu assoziierte Regulatorproteine kontrolliert: Arginin-Konzentration (ArgR), Sauerstoffpartialdruck (FlpS) und Glukosekonzentration (CcpA). ArgR ist ausschließlich für die Substrat-induzierte Aktivierung des arcABC-Operons verantwortlich. FlpS ist ein Sauerstoff-abhängiger Aktivator der arcABC-Expression, allerdings ist er auch an der Regulation weiterer metabolischer Gene beteiligt. Sowohl ArgR als auch FlpS sind essentiell für die arcABC-Induktion und tragen dadurch zum intrazellulären Überleben von S. suis bei. Letztlich ist CcpA indirekt für die Repression des Operons in der Anwesenheit von Glukose notwendig. Daher kontrollieren CcpA, ArgR und FlpS jeder auf seine Art eine effiziente Adaptation des Metabolismus und die Virulenz von S. suis.

Die Ergebnisse dieser Habilitationsschrift stellen einen wesentlichen Beitrag zur Pathogeneseforschung von S. suis dar. Sie zeigen die enge Verknüpfung eines Wirts-adaptierten Metabolismus zu der Pathogenität von S. suis. Vor allem hinsichtlich der hier beschriebenen Stoffwechselarbeiten lassen sich zentrale Aspekte auf den durchaus konservierten Zentralstoffwechsel anderer pathogener Streptokokken übertragen. Inwieweit sich aus diesen metabolischen Studien Strategien für eine bessere Immunprophylaxe und/oder Therapie von S. suis-Infektionen ableiten lassen, müssen zukünftige Arbeiten zeigen.

Summary

Streptococcus (S.) suis is one of the most important porcine pathogens with increasing attention as a zoonotic agent predominately in Asia. In pigs, S. suis frequently colonizes the mucosa of the upper respiratory tract without causing disease. However, S. suis can also cause invasive diseases such as septicemia, endocarditis, and meningitis. Little is known about the pathogenicity of S. suis. On the one hand, pathogenicity of S. suis is determined by the expression of virulence factors. On the other hand, S. suis needs to efficiently adapt to different host environments with varying nutrient compositions such as the mucosal tissue of the upper respiratory tract, the blood circulation system, and the cerebrospinal fluid (CSF). One main objective of this work was the characterization of the metabolic adaptation of S. suis to its host. Furthermore, this work provides evidence how pivotal metabolic processes are regulated and how metabolic adaptation influences virulence of S. suis. Following aims became focus of this work:

·         Establishment of an efficient method for genetic manipulation of S. suis as a general prerequisite for functional analysis of the central metabolism and its regulation

·         Characterization of the adaptation of the central carbohydrate metabolism and the amino acid biosynthesis of S. suis to chemically defined conditions and different host environments

·         Relevance of the arginine deiminase system (ADS) as a secondary energy providing amino acid degradation pathway for the metabolic adaptation of S. suis

Similar to other pathogenic streptococci, S. suis utilizes different carbohydrate sources for growth. Glucose is the preferred growth substrate and can be used to synthesize most amino acids. However, S. suis cannot synthesize all amino acids and needs to import essential amino acids. Isotopologue profiling experiments showed that glucose is predominantly metabolized by the glycolysis, also called Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway, and to minor extent by the pentose phosphate pathway (PPP). To compensate a fragmentary tricarboxylic acid cycle (TCA), oxaloacetate is synthesized from phosphoenolpyruvate by a phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc) reaction. The essentiality of this reaction was demonstrated by genetic deletion of the ppc gene in S. suis. Isotopologue profiling experiments also allowed to reconstruct amino acid biosynthesis pathways. They revealed that amino acids were synthesized de novo from metabolic intermediates of the EMP pathway, PPP and the phosphoenolpyruvate carboxylase reaction. Additional isotopologue profiling experiments in porcine blood and CSF showed that similar central metabolic pathways were active in these host environments. However, in CSF S. suis seemed to establish an increased demand of aromatic and branched chain amino acids compared to blood. This is supported by lower amino acid concentrations measured in CSF than in porcine serum and genome-wide transcriptomic analysis showing an upregulation of several biosynthetic genes for these amino acids. In blood, the uptake and metabolism of alternative carbohydrate sources, the PPP and the linked nucleotide biosynthesis seem to be important as deduced from the transcriptome analysis.

An important transcription factor in regulating carbohydrate metabolism and virulence of S. suis is the catabolite control protein A (CcpA). This work reveals CcpA as a glucose-dependent global regulator of metabolic and virulence-associated genes. CcpA specifically regulates by recognizing highly conserved DNA binding motifs in regulatory elements of CcpA-controlled genes. Remarkably, CcpA controls the expression of the most prominent virulence factor of S. suis, the polysaccharide capsule. This properly explains the virulence attenuation of a ccpA deficient strain of S. suis.

In addition to the central carbohydrate metabolism, amino acid degradation pathways can also provide energy. The arginine degrading ADS of S. suis is one example and the genetic information for the central enzymatic activity of this pathway is located on the arcABC operon. The gene products of the arcABC operon metabolize arginine to ornithine, ammonia and carbon dioxide, and concomitantly produce energy in form of ATP. This work showed that the ADS of S. suis contributes to the intracellular survival in eukaryotic cells by providing ammonia and ATP for neutralization of the pH value of the endosome. ArcD, the ADS-associated arginine-ornithine antiporter is important for the functionality of the system by providing the substrate arginine even though additional arginine transporters exist. ArcABC regulation is tightly controlled by physiological signals which can be linked to the activity of specific regulators: arginine concentration (ArgR), oxygen pressure (FlpS), and glucose concentration (CcpA). CcpA indirectly represses the arcABC operon expression under glucose rich conditions. ArgR is exclusively involved in the substrate-induced activation of the arcABC operon. FlpS is an oxygen-dependent activator of the arcABC expression but can also regulate other metabolic genes. ArgR and FlpS both are essential for arcABC induction and by this promote the intracellular survival of S. suis. Overall, CcpA, ArgR, and FlpS each contribute in specific ways to an efficient metabolic adaptation and virulence of S. suis.

In conclusion, the presented work provides some principles on the pathogenicity of S. suis. For S. suis pathogenicity, it emphasizes the importance of the metabolic adaptation to the host which can be used for future metabolome studies even in other pathogenic streptococci. To which extent this work might be translated into successful concepts for immuneprophylaxis and/or therapy of S. suis infections needs, however, to be evaluated in the future.

keywords

Streptococcus suis, Metabolismus, Genregulation
Streptococcus suis, metabolism, gene regulation

kb

1.351