HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Reiner Georg Ulrich

 

Microarray-basierte

Transkriptomanalysen bei

demyelinisierenden Erkrankungen des

Zentralnervensystems

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2718

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_ulrich14.pdf

Zusammenfassung

Demyelinisierende Erkrankungen des Zentralnervensystems werden trotz ihrer unterschiedlichen Ätiologie und Pathogenese in der Systematik der speziellen Pathologie meist als morphologisch verwandte Gruppe mit primärem Verlust der Myelinscheiden bei relativem Erhalt der Axone zusammengefasst. Einleitend wird in dieser Habilitationsschrift eine Übersicht über natürlich vorkommende primäre Entmarkungserkrankungen beim Menschen und den Haustieren gegeben. Es folgt eine Betrachtung der historischen Entwicklung des Genbegriffes bis hin zur heutigen Definition des Gens als funktionell zusammenhängendem Teil der genomischen DNS, der für eine Gruppe von biologisch aktiven, eventuell überlappenden Produkten kodiert. Darüber hinaus wird ein kurzer Überblick über die molekularen Prozesse gegeben, die an dem im zentralen Dogma der Molekularbiologie zusammengefassten Informationsfluss von der DNS über die mRNS zum Protein beteiligt sind. In diesem Zusammenhang wird auf die fundamentalen Möglichkeiten und Grenzen von Genexpressionsmessungen auf Ebene des Transkriptoms hingewiesen.

Der Grundgedanke zur Anfertigung dieser Habilitationsschrift war die vergleichende Untersuchung von multiplen natürlich vorkommenden und experimentellen Entmarkungserkrankungen. Der Schwerpunkt wurde hierbei auf die Analyse von Mikroarray-basierten transkriptionellen Daten gelegt.

Die elf in dieser Habilitationsschrift zusammengefassten Publikationen lassen sich fünf Zielen zuordnen:

Der Charakterisierung der Immunreaktion bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis.

Der Beschreibung der Axonopathie bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis.

Der Untersuchung der pathogenetischen Bedeutung von Matrix-Metalloproteinasen bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis und dem Cuprizon-Entmarkungsmodell.

Einer Metaanalyse der transkriptionellen Veränderungen bei Multipler Sklerose und verschiedenen experimentellen Entmarkungserkrankungen.

Der Beschreibung des Transkriptoms bei der Staupe-Leukoenzephalitis.

Die durch den BeAn-Stamm des Theilervirus ausgelöste Polioenzephalitis fand innerhalb der ersten Woche nach der Infektion ihren Höhepunkt und ging bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen mit prinzipiell gleichartigen histologischen Veränderungen einher. Auf molekularer Ebene lagen jedoch bereits zu diesem Zeitpunkt Unterschiede wie eine höhere Tumor-Nekrose-Faktor (Tnf)-Expression bei den C57BL/6-Mäusen und ein höherer Prozentsatz FOXP3-positiver immunregulatorischer T-Zellen bei den SJL/J-Mäusen vor. Zu späteren Zeitpunkten war bei den beiden Mäusestämmen dann ein unterschiedlicher Zelltropismus zu beobachten. Während es bei SJL/J-Mäusen zu einer progressiven demyelinisierenden Leukomyelitis kam, konnten die C57BL/6-Mäuse die Infektion überwinden. Mittels Mikroarray-Analysen konnte gezeigt werden, dass bei SJL/J-Mäusen die Halslymphknoten in der Poliomyelitisphase an der Initiation der adaptiven Immunantwort beteiligt waren, wohingegen in der Spätphase nur noch unbedeutende transkriptionelle Veränderungen in den lymphatischen Organen nachweisbar waren. Dieser Befund stützt die Vermutung, dass in der chronisch progressiven Entmarkungsphase eine eigenständige, hinter der Blut-Hirn-Schranke eingeschlossene intrathekale Immunreaktion abläuft.

Eine im Rahmen der durch den BeAn-Stamm des Theilervirus ausgelösten initialen Polioenzephalitis entstehende und auch in der chronisch progressiven demyelinisierenden Erkrankungsphase nachweisbare Axonopathie war ein nur bei SJL/J-, nicht aber C57BL/6-Mäusen zu beobachtendes Phänomen. Dieser Befund stützt die Hypothese einer axonalen Virusausbreitung und initialen Läsionsentstehung im Sinne der „inside-out“-Hypothese. Mittels molekularer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Axonopathie mit einer Störung von axonalen Transportmechanismen einhergeht. Eine Mikroarray-basierte Untersuchung deutete darauf hin, dass es zu einer Aktivierung eines axonalen Selbstzerstörungsmechanismus kommt, welcher der angeborenen antiviralen Immunabwehr zugerechnet wird.

Bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis und dem Cuprizon-Entmarkungsmodell konnte vor allem eine Aufregulierung der Matrix-Metalloproteinase (Mmp)12 im Zusammenhang mit der Demyelinisierung beobachtet werden. Trotz der Aufregulierung dieser potentiell die extrazelluläre Matrix spaltenden Protease konnte eine progrediente Astrogliose mit begleitender intraläsionaler Akkumulation von extrazellulärer Matrix bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis beobachtet werden. Mittels transkriptioneller Analysen wurde eine Aufregulierung des transformierenden Wachstumsfaktors ß als ein möglicherweise die Sklerose induzierender Signalweg ermittelt. Die Untersuchung von Mmp3-/- und Mmp12-/- „knock-out“ Mäusen im Modell der Theilervirus-Enzephalomyelitis zeigte, dass der MMP12 eine bedeutende Rolle in der Pathogenese der Entmarkung und Extravasation von Makrophagen zukommt. Mittels einer direkten Injektion von MMP3, -9, und -12 in den kaudalen zerebellären Pedunkel von SJL/J-Mäusen konnte eine direkte myelino- und oligodendrogliotoxische Aktivität nachgewiesen werden.

Bei der Metaanalyse von Mikroarray-basierten Datensätzen der Multiplen Sklerose, Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis, Theilervirus-Enzephalomyelitis und einem transgenen TNF-überexprimierenden Mausmodell wurden nur sehr wenige Übereinstimmungen der transkriptionellen Veränderungen bei der Multiplen Sklerose verglichen mit ihren experimentellen Tiermodellen gefunden. Eine hypothesengestützte Untersuchung von selektierten, pathomechanistisch bedeutsamen funktionellen Kategorien zeigte, dass die molekulare Pathogenese bei der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis und der Theilervirus-Enzephalomyelitis dem Multiple Sklerose Subtyp II und bei dem transgenen TNF-überexprimierenden Mausmodell dem Multiple Sklerose Subtyp I am ähnlichsten ist.

Die mittels Mikroarrays im Kleinhirn gemessenen transkriptionellen Veränderungen bei der Staupe-Leukoenzephalitis deuten auf einen biphasischen Entmarkungsvorgang hin, der durch eine oligodendrogliale Dystrophie initiiert und in der entzündlichen Erkrankungsphase durch eine antikörpervermittelte Überempfindlichkeitsreaktion fortgeführt wird. Die initiale oligodendrogliale Dystrophie könnte ein Äquivalent zum Multiple Sklerose Subtyp III oder IV und die späte antikörpervermittelte Überempfindlichkeitsreaktion ein Äquivalent zum Multiple Sklerose Subtyp II sein.

In der studienübergreifenden Diskussion wurde noch einmal ein systematischer Vergleich der Multiplen Sklerose, Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis, Theilervirus-Enzephalomyelitis, dem transgenen TNF-überexprimierenden Mausmodell und der Staupe-Leukoenzephalitis durchgeführt um der Frage nachzugehen, ob die geringe Übereinstimmung der Multiplen Sklerose mit den Entmarkungsmodellen möglicherweise auf die Besonderheiten der verwendeten Labornager zurückzuführen ist. Aber auch nach der Hinzuziehung der Staupe als Großtiermodell einer Entmarkungserkrankung in die Metaanalyse blieb die relative Alleinstellung der Multiplen Sklerose erhalten. Die beste Erklärung hierfür ist ein Überwiegen von inaktiven Läsionszentren im Probenmaterial der verfügbaren Multiple Sklerose-Datensätze, wohingegen bei allen anderen Entmarkungserkrankungen selektiv Erkrankungsphasen mit aktiver Entmarkung ausgewählt wurden. Innerhalb der bei den Entmarkungserkrankungen am häufigsten differenziell exprimierten Gene konnte ein Assoziationsnetzwerk ermittelt werden, das mit der lysosomalen Degradation von Proteinen, der Präsentation von Antigenen mittels Histokompatibilitätsantigenen der Klasse I und II, der Interferon Typ I-Antwort und der klassischen Komplementaktivierung in funktionellem Zusammenhang steht und interessante Kandidaten für von der ursächlichen Ätiologie unabhängige therapeutische Ansätze zur Behandlung von Entmarkungserkrankungen enthalten könnte.

Schlussfolgernd ist die Pathogeneseforschung der Multiplen Sklerose auf vielfältige Tiermodelle angewiesen, in denen die unterschiedlichen möglichen Wege der akuten Läsionsentstehung untersucht werden können, da die von der Multiplen Sklerose selbst vorhandenen Datensätze vermutlich nur sekundäre Degenerations-, Regenerations- und Reparationsprozesse widerspiegeln.

 

Summary

Despite their heterogeneous etiology and pathogenesis, the classification system used in systemic pathology merges the demyelinating diseases of the central nervous system into a group of morphologically related illnesses characterized by primary loss of myelin and relative preservation of axons. The introduction of the present thesis includes a survey of the multitude of naturally occurring primary demyelinating diseases of men and companion animals. This is followed by a review of the historical development of the definition of what a gene is about, up to the current working hypothesis that „A gene is a union of genomic sequences encoding a coherent set of potentially overlapping functional products.” Furthermore, the processes involved in the flow of information from DNA to mRNA to protein and summarized in the central dogma of molecular biology are discussed in the context of the fundamental chances and pitfalls of gene expression assays at the level of the transcriptome.

The basic idea leading to the compilation of this thesis was a comparative examination of multiple naturally-occurring and experimentally-induced primary demyelinating diseases. Thereby the focus was set to the analysis of microarray-based transcriptional data.

The eleven publications summarized in this thesis can be allocated to five aims:

The characterization of the immune reaction in Theiler’s murine encephalomyelitis.

The description of the axonopathy in Theiler’s murine encephalomyelitis.

The investigation of the pathogenic role of matrix-metalloproteinases in Theiler’s murine encephalomyelitis and cuprizone-induced demyelination.

A meta-analysis of transcriptional changes in multiple sclerosis and its experimental models.

The description of the transcriptional changes in canine distemper virus-induced demyelinating leukoencephalitis.

The BeAn-strain of Theiler’s murine encephalomyelitis virus induced a polioencephalitis that reached its maximum within the first week after infection and resulted in principally similar pathohistological alterations in SJL/J and C57BL/6 mice. However, at that time point, there were already differences at the molecular level, including up-regulated tumor necrosis factor (Tnf) expression in C57BL/6 mice and a higher percentage of FOXP3-positive immunoregulatory T-cells in SJL/J mice. A different cellular tropism of the virus was observed in these mouse strains at later time points. While SJL/J mice developed a progressive demyelinating leukomyelitis, the virus infection was cleared in C57BL/6 mice. Microarray analysis revealed an involvement of the cervical lymph nodes in the initiation of the adaptive immune response during the poliomyelitis phase in SJL/J mice, while only minimal transcriptional changes were observable in the lymphatic organs at later time points. This result supports the hypothesis of an isolated intrathecal immune reaction trapped behind a closed blood-brain-barrier in the chronic progressive demyelinating phase of Theiler’s murine encephalomyelitis.

An axonopathy was observed in SJL/J but not C57BL/6 mice during the initial polioencephalitis as well as the chronic progressive demyelinating leukomyelitis induced by the BeAn-strain of Theiler’s murine encephalomyelitis. This supports the hypothesis of an axonal virus spread and initiation of the demyelinating lesions in accordance with the „inside-out” hypothesis. Further experiments revealed an association of the axonopathy with a disruption of the molecular axonal transport mechanisms. Microarray analysis revealed transcriptional changes suggestive of an activated axonal self-destruction program involved in the innate anti-virus defence.

An up-regulation of matrix-metalloproteinase (Mmp)12 in association with demyelination was observed in Theiler’s murine encephalomyelitis and cuprizone-induced demyelination. Despite the up-regulation of this protease, known to be able to degrade a magnitude of extracellular matrix proteins, a progressive intralesional astrogliosis and concomitant deposition of extracellular matrix was observed in Theiler’s murine encephalomyelitis. Microarray analysis suggested that an up-regulation of transforming growth factor ß may represent a possible pathway inducing sclerosis. The employment of Mmp3-/- and Mmp12-/- knock-out mice within the Theiler’s murine encephalomyelitis model of demyelination revealed that MMP12 is a key factor for the pathogenesis of demyelination and extravasation of macrophages. The injection of MMP3, -9, and -12 into the caudal cerebellar peduncle of SJL/J mice highlighted their direct myelino- and oligodendrotoxic potential.

The meta-analysis of microarray-based data sets from multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalomyelitis, Theiler’s murine encephalomyelitis and a transgenic TNF-overexpressing mouse model revealed only scant concordance of the transcriptional changes in multiple sclerosis as compared to its experimental models. A hypothesis-driven examination of selected pathomechanistically relevant functional „Gene Ontology” categories revealed that the pathogenesis of experimental allergic encephalomyelitis and Theiler’s murine encephalomyelitis resembles multiple sclerosis pattern II and the transgenic TNF-overexpressing mouse model resembles multiple sclerosis pattern I.

Microarray-analysis of the changes in the transcriptome in canine distemper virus-induced demyelinating leukoencephalitis suggested a unique biphasic pathogenesis of demyelination in this disease. Accordingly, demyelination seems to be initiated by an oligodendrocyte dystrophy, and is continued by an immunoglobulin-dependent hypersensitivity reaction in the subacute to chronic inflammatory phase. The suggested initial oligodendrocyte dystrophy could be an equivalent to multiple sclerosis patterns III or IV, and the immunoglobulin-dependent hypersensitivity reaction could be an equivalent to multiple sclerosis pattern II.

The comprehensive discussion of this thesis was guided by the idea of a systematic comparison of multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalomyelitis, Theiler’s murine encephalomyelitis, the TNF-overexpressing mouse model, and canine distemper virus-induced demyelinating leukoencephalitis in order to clarify whether the lack of concordance of multiple sclerosis with its experimental models may be due to the peculiarities of rodents. However, the relative isolation of multiple sclerosis remained unaltered, even after the inclusion of the large animal model canine distemper virus-induced demyelinating leukoencephalitis into the meta-analysis. The best explanation for this is an overweight of inactive lesion centres within the samples used for the generation of the currently available multiple sclerosis data sets. In contrast, actively demyelinating lesions dominated in the samples used for all other diseases. The genes most commonly affected in all demyelinating diseases contained a network based on protein to protein associations that is functionally involved in lysosomal degradation of proteins, presentation of antigens via major histocompatibility antigens of class I and class II, the interferon type I response and the classical pathway of complement activation. This network may contain interesting candidates for therapeutic interventions that function in demyelinating diseases regardless of the causative etiology.

Conclusively, pathogenesis research in multiple sclerosis is highly dependent on a wide variety of animal models which resemble the different possible avenues to demyelination, since the data sets available from multiple sclerosis itself are suggested to reflect only secondary, degenerative, regenerative and reparative changes.

 

keywords

Entmarkung, Zentralnervensystem, Microarray, demyelination, central nervous system, microarray

kb

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