HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Frauke Seehusen

 

Vergleichende Untersuchungen über die Pathogenese von

Axonschäden und Remyelinisierung bei Enzephalitiden sowie

genetischen Defekten des zentralen Nervensystems

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2838

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 201X

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_seehusen17.pdf

Zusammenfassung

Demyelinisierende Erkrankungen des ZNS wurden lange Zeit als eine ätiologisch heterogene Gruppe betrachtet, in der ein primärer Myelinverlust mit Bewahrung der Integrität von axonalen Strukturen einhergeht. Sowohl bei der multiplen Sklerose des Menschen als auch ihren Tiermodellen, wie der kaninen Staupevirusinfektion, wandelte sich dieses Paradigma in den vergangenen Jahren. Doch die zugrundeliegende Pathogenese von Axonopathien sowie die Einfluss von verschiedenen zellulären und azellulären Faktoren im Hinblick auf axonwachstumsfördernde oder -inhibierende Eigenschaften war bislang ungeklärt. Außerdem fehlt es bei Erkrankungen mit neurologischen Ausfällen, bei denen ein genetischer Defekt als Ursache vermutet wird, häufig an einer genauen Charakterisierung, sowohl auf molekularer als auch auf morphologischer Ebene. Auf der Suche nach möglichen neuartigen regenerativen Therapieansätzen wurde man in jüngster Vergangenheit auf potentiell remyelinisierende aldynogliale Zellen, die zentralen Schwann-Zellen, aufmerksam.

Einleitend wird in dieser Habilitationsschrift eine Übersicht über den Aufbau von Axonen inklusive der Komponenten des axonalen Transports sowie die Bedeutung von Axonopathien bei entzündlichen und degenerativen ZNS-Erkrankungen gegeben. Es folgt eine Beschreibung des Neurotrophin-Rezeptors p75NTR und seine Expression in verschiedenen Reifungsstadien von Schwann-Zellen sowie der Einfluss von Schwann-Zellen auf die Remyelinisierung als regenerativer Prozess bei neurodegenerativen Erkrankungen. Zudem folgt eine Übersicht über die in dieser Arbeit untersuchten Erkrankungen beim Hund (Staupevirus-Infektion, granulomatöse Meningoenzephalitis [GME] und neuroaxonale Dystrophie [NAD]) und bei der Maus (Theiler´sche murine Enzephalomyelitis [TME] und eine Mutation im Dystonin-Gen).

Der Grundgedanke bei der Anfertigung dieser Habilitationsschrift war die vergleichende Betrachtung von verschiedenen, natürlich vorkommenden und experimentellen neurodegenerativen Erkrankungen unter Verwendung diverser in situ- und in vitro-Methoden.

Die zehn in dieser Habilitationsschrift zusammengefassten Publikationen lassen sich sechs Bereichen zuordnen:

1.      Charakterisierung der Pathogenese von Axonschäden bei der Staupevirus-induzierten demyelinisierenden Leukoenzephalitis

2.      Charakterisierung der extrazellulären Matrix bei der Staupevirus-induzierten, demyelinisierenden Leukoenzephalitis

3.      Beschreibung und Charakterisierung von p75NTR-positiven Schwann-Zellen im Gehirn von Hunden mit einer Staupevirus-induzierten, demyelinisierenden Leukoenzephalitis und einer granulomatösen Meningoenzephalitis

4.      Charakterisierung von neurodegenerativen Veränderungen bei einer neuen kaninen Form der neuroaxonalen Dystrophie mit einem Defekt im tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 (TECPR2)-Gen

5.      Charakterisierung der Pathogenese von Axonopathien bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis

6.      Charakterisierung von neurodegenerativen Veränderungen bei der murinen Dystonia musculorum

 

Bei der kaninen demyelinisierenden Staupeenzephalitis zeigte sich neben einer gesteigerten Immunreaktivität für das nicht-phosphorylierte Neurofilament (n-NF), einem etablierten Marker für geschädigte Axone, in der Folge auch ein Verlust von Zytoskelett-Struktur- und Motorproteinen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen auf Proteinebene kam es in chronischen Läsionen im Vergleich zu subakuten Herden zu einer Aufregulierung von Genen, die für Neurofilament-Untereinheiten und Motorproteine kodieren. Auf immunhistologischer Ebene zeigten sich Hinweise auf eine axonale Regeneration durch eine axonale Immunreaktivität für HIF1α, wohingegen GAP-43, Erythropoietin und sein Rezeptor nicht bzw. runterreguliert waren.

Die extrazelluläre Matrix (EZM), die generell als eher axonwachstumsinhibierend gilt, war bei CDV-infizierten Hunden im Vergleich zu Kontrollhunden in Quantität und Qualität verändert. Die Aggrecan-Expression war in frühen und späten Läsionen erhöht, während die Expression von Kollagen Typ I und IV und Fibronektin vor allem in späten Läsionen aufreguliert war. Im Gegensatz dazu war die Expression von Phosphacan bereits in frühen, allerdings deutlicher in späten Läsionen im Vergleich zu den Kontrollen vermindert. Auf Transkriptomebene war insbesondere die Genexpression von Matrix-modulierenden Enzymen aufreguliert. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass Veränderungen in der Zusammensetzung und Menge der EZM wichtige posttranskriptionelle Ereignisse vor allem in späten CDV-Läsionen darstellen. Die akkumulierte EZM behindert vermutlich regenerative Prozesse im Rahmen der Staupeenzephalitis.

p75NTR-positive Schwann-Zellen wurden sowohl in Läsionen der kaninen Staupeenzephalitis als auch der GME nachgewiesen. Allerdings waren bei der Staupeenzephalitis nur vereinzelt in wenigen späten Läsionen P0- und Periaxin-positive Zellen, die auf eine Schwann-Zell-Remyelinisierung hindeuten, zu detektieren. Bei der GME exprimierten ca. 2/3 der p75NTR-positiven Zellen zusätzlich den Transkriptionsfaktor SOX2. Bei ca. 1/3 der GME-Läsionen zeigten sich zudem Periaxin- und P0-positive Zellen, was als Zeichen einer Schwann-Zell-Myelinisierung interpretiert wurde. Zusätzlich wiesen Hirnstammläsionen ohne p75NTR-positive Schwann-Zellen eine signifikant größere Anzahl an geschädigten Axonen als Läsionen mit p75NTR- oder p75NTR-/Periaxin-positiven Zellen auf. Somit können p75NTR-/SOX2-positive Zellen bei der GME als ein früher regenerativer Prozess interpretiert werden. Bei der CDV-Infektion stellt früh auftretende Axonschaden wahrscheinlich ein frühes Trigger-Signal für die Differenzierung von p75NTR-exprimierenden Schwann-Zellen dar, die aber im Gegensatz zur GME in der Mehrzahl in einem unreifen, prämyelinisierenden Stadium verbleiben.

Eine bereits im juvenilen Alter auftretende neuroaxonale Dystrophie (NAD) beim Spanischen Wasserhund, die ursächlich auf eine Mutation im kaninen tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 (TECPR2)-Gen zurückgeführt werden konnte, stellte sich morphologisch durch neuronale Degenerationen in der grauen Substanz des Großhirns, des Kleinhirn und einiger Kerngebiete des Stammhirns dar. Zudem waren im Rückenmark ein Verlust von Neuronen und/oder die Bildung von Sphäroiden in sensorischen Kerngebieten bzw. Nervenbahnen nachweisbar. In den Sphäroiden kam zu einer Akkumulation von Autophagosomen, so dass pathogenetisch eine Beeinträchtigung des Autophagieprozesses angenommen wird.

Bei einer experimentellen Infektion mit TMEV bei empfänglichen Mäusen des SJL/J-Stammes konnten bereits früh im Krankheitsverlauf auftretende Axonschäden nachgewiesen werden. Die Axonopathien traten zeitlich vor der Demyelinisierung auf und bestätigen somit das inside-out-Modell des primären Axonschadens, vermutlich in Folge der Virusinfektion, mit sekundärer Demyelinisierung. Diese Veränderung konnte nicht nur auf der Protein- sondern in gewissem Maße auch auf der Transkriptomebene nachvollzogen werden. Die Runterregulierung der Genexpression von den Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-produzierenden Enzymen NMAT1 und NMAT2 sowie die Aufregulierung des Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-verbrauchenden Enzyms PARP1 bei TMEV-infizierten Mäusen deutet auf ein selbstinitiiertes, axonales Destruktionsprogramm hin, welches in Folge einer Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Depletion auftritt. Bei vergleichenden Untersuchungen in Groß- und Kleinhirn zwischen empfänglichen SJL/J- und nicht-empfänglichen C57BL/6-Mäusen zeigten sich Axonschäden bzw. eine verringerte Axondichte nur bei dem SJL/J-Mäusen im Rahmen einer TMEV-Infektion.

Eine neue, spontan aufgetretene Mutation im Dystonin-Gen bei C57BL/6N-Mäusen, die die Erkrankung Dystonia musculorum verursacht, führte zu einem vollständigen Verlust des Dystonin-Proteins in mehreren Organsystemen inklusive des ZNS bei erkrankten homozygoten Mäusen. Die vorherrschenden histopathologischen Veränderungen von dt-MP-Tieren bestanden aus Axonschäden und weiteren neurodegenerativen Veränderungen, die hauptsächlich auf sensorische neuronale Kerngebiete und nur auf wenige motorische Nuclei beschränkt waren. Diese Befunde sprechen pathogenetisch für eine primäre Axonopathie mit sekundären degenerativen Veränderungen im Soma in Sinne eines dying back-Phänomens.

Bei der studienübergreifenden Diskussion wurden noch einmal systematisch vergleichend das Ausmaß der Axonschäden und Unterschiede in der Pathogenese zwischen den verschiedenen Erkrankungen (Staupe, TME, NAD und Dystonia musculorum) verdeutlicht. Zudem zeigten sich Unterschiede in der Differenzierung von potentiell remyelinisierenden Schwann-Zellen bei der kaninen Staupeenzephalitis und der GME.

Axonschädigungen laufen nicht stereotyp ab, sondern weisen bei den verschiedenen Krankheiten, die in dieser Arbeit untersucht wurden, Unterschiede in der Lokalisation, im zeitlichen Ablauf und bezüglich der betroffenen Substrukturen auf. Aufgrund dessen entstehen vielfältige Interventionsmöglichkeiten bei der Prävention und Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen. Insbesondere bei der GME zeigte sich, dass Schwann-Zellen im ZNS einen ähnlichen Phänotyp wie bei Schädigungen des PNS aufweisen. So kommen eine Dedifferenzierung, eine Infiltration von peripheren Schwann-Zellen in das ZNS und eine Redifferenzierung von Schwann-Zell-Vorläuferstadien als regenerative Mechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen des Gehirns in Frage. Daher stellen die p75NTR-/SOX2-positiven Zellen durch ihr regeneratives Potential einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz bei entzündlich-degenerativen ZNS-Erkrankungen dar.

 

keywords

Demyelinating diseases of the central nervous system are an etiologically heterogeneous group, in which a primary loss of myelin is accompanied by preservation of the axonal integrity. In the last years, there was a paradigm shift in multiple sclerosis in humans as well as in its animal models like canine distemper virus (CDV) infection. Nevertheless, the pathogenesis of axonopathies and the influence of several cellular and acellular factors on axonal growth promoting or inhibitory properties were not investigated so far. Additionally, in diseases with neurological deficits and a suspected genetic mutation as a possible cause a detailed characterization on a molecular and morphological level is often missing. New therapeutical strategies in demyelinating diseases include potentially remyelinating aldynoglial cells, also known as central Schwann cells.

 

In the introduction, an overview concerning the structure of axons, axonal transport, relevance of axonopathies in inflammatory and degenerative diseases of the central nervous system (CNS) is given followed by a description of the neurotrophin receptor p75NTR and its expression in several differentiation stages in Schwann cells. The influence of remyelinating Schwann cells as a regenerative process on neurodegenerative processes is briefly described. In addition, the canine and murine diseases (canine distemper virus infection, granulomatous meningoencephalitis [GME], neuroaxonal dystrophy [NAD], Theiler`s murine encephalomyelitis [TME] and dystonia musculorum) investigated in this habilitation were delineated.

 

The aim was the comparative contemplation of different naturally occurring and experimentally induced CNS diseases using several in situ and in vitro methods.

 

The ten publications summarized in this thesis can be allocated to six aims:

 

1.     Characterization of the pathogenesis of axonal damage in CDV-induced demyelinating leukoencephalitis

 

2.     Characterization of changes in the quality and quantity of extracellular matrix in CDV-induced demyelinating leukoencephalitis

 

3.     Description and characterization of p75NTR-positive Schwann cells in the brain of dogs with CDV-induced demyelinating leukoencephalitis and GME

 

4.     Characterization of neurodegenerative changes in a new variant of NAD based on a mutation in the canine tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 (TECPR2) gene

 

5.     Characterization of the pathogenesis of axonopathies in TME

 

6.     Characterization of neurodegenerative changes in a new variant of murine dystonia musculorum

 

 

 

In canine distemper demyelinating leukoencephalitis, an increased immunoreactivity of non-phosphorylated neurofilament, a marker for damaged axons, was accompanied by loss of cytoskeletal and motor proteins. In contrast to the results on the protein level, transcriptional upregulation of genes, which code for neurofilament subunits and motor proteins, was detected in chronic lesions compared to subacute lesions. Immunohistochemically, hints for regeneration were obvious, consisting of axonal immunoreactivity for HIF1α. Nevertheless, GAP-43, erythropoietin and its receptor showed no regulation or were downregulated.

 

The extracellular matrix (ECM) is regarded as a mainly axonal growth inhibitory factor. In CDV-infected dogs, changes in the quality and quantity of the ECM were detected compared to controls. Aggrecan expression was upregulated in early and late lesions, whereas the expression of collagen type I and IV as well as fibronectin was upregulated mainly in late lesions. In contrast, expression of phosphacan was downregulated in early and late lesions compared to controls. Transcriptome analysis showed an upregulation of ECM modulating enzymes. Summarized, changes in the composition and quantity represent mainly posttranscriptional events especially in late CDV lesions. The accumulated ECM is supposed to restrain regenerative processes in canine distemper encephalitis.

 

p75NTR-positive Schwann cells were detected in CDV-induced lesions as well as in canine granulomatous meningoencephalitis. However, in few late CDV lesions only single P0- and periaxin-positive cells, which are indicative of Schwann cell remyelination, could be detected. In GME, approximately two thirds of p75NTR-positive cells coexpressed the transcriptional factor SOX2. About one third of the GME lesions showed periaxin- and P0-positive cells, interpreted as Schwann cell myelination. Additionally, lesions in the brainstem without p75NTR-positive Schwann cells showed a significantly higher number of damaged axons compared to lesions with p75NTR- or p75NTR-/periaxin-positive cells. In conclusion, p75NTR-/SOX2-positive cells in GME lesions could be interpreted as an early regenerative process. In CDV infection, the early axonal damage may represent a triggering factor for the differentiation of p75NTR expressing Schwann cells. Nevertheless, in contrast to GME, p75NTR-positive cells remain in an immature premyelinating state.

 

A juvenile-onset form of NAD in the Spanish waterdog is in a causal relationship with a mutation in the canine tectonin beta-propeller repeat-containing protein 2 (TECPR2) gene. Morphologically, the disease is characterized by neuronal degeneration in the grey matter of cerebrum and cerebellum as well as in some nuclei in the brainstem, respectively. Additionally, a neuronal loss and spheroid formation were detectable in sensory nuclei and nerve tracts of the spinal cord. Spheroids showed an accumulation of autophagosomes, so that pathogenetically a disturbance of the autophagy process was supposed.

 

In experimental TMEV infection, susceptible SJL/J mice showed axonal damage early in the course of the disease. Axonopathies occurred before demyelination which verified the hypothesis of the inside-out model of primary axonal damage with secondary demyelination as a result of viral infection. These changes were mirrored not only at the protein level but also in the transcriptome analysis. In TMEV-infected mice, downregulation of nicotinamide-adenine-dinucleotide synthesizing enzymes NMAT1 and NMAT2 and upregulation of nicotinamide-adenine-dinucleotide metabolizing enzyme PARP1 point towards an axonal self-destructive program as a consequence of nicotinamide-adenine-dinucleotide depletion. In cerebrum and cerebellum, susceptible SJL/J mice showed significantly more axonale damage and a decreased axonal density after TMEV infection compared to non-susceptible C57BL/6 mice.

 

A new spontaneous mutation in the dystonin gene of C57BL/6N mice, which causes the disease dystonia musculorum, caused complete loss of dystonin protein in multiple organ systems including the central nervous system in homozygous mice. Histopathological changes consisted of axonal damage and other neurodegenerative findings which could be found mainly in sensory nuclei in the brainstem and few motor neurons. Pathogenetically, a primary axonopathy with secondary degenerative changes in the neuronal soma in terms of a dying back phenomenon was supposed.

 

The comprehensive discussion of this thesis was composed of a systematic comparison of the extent of axonopathies and differences in the pathogenesis in different diseases (distemper, TME, NAD and dystonia musculorum, respectively). Additionally, disparities in the differentiation of potentially remyelinating Schwann cells in canine distemper encephalitis and GME were detected.

 

Consecutively, axonopathies do not comprise stereotype procedures but exhibit differences in location, temporal distribution and affected substructures concerning investigated diseases in this thesis. Therefore, many intervention strategies in prevention and therapy of neurodegenerative diseases can be established in further studies. In GME, Schwann cells showed a phenotype similar to the peripheral nervous system. Consequently, a dedifferentiation, an infiltration of Schwann cells from the periphery and a redifferentiation of glial precursor cells are possible regenerative mechanisms for neurodegenerative diseases, respectively. p75NTR-/SOX2-positive cells may represent a promising therapeutical approach in inflammatory-degenerative CNS diseases.

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