HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Christel Schwegmann-Weßels

 

 

Erreger-Wirt-Interaktionen intestinaler und respiratorischer RNA-Viren

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2669

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_schwegmann-wessels14.pdf

Zusammenfassung

Viren interagieren in jeder Phase ihres Replikationszyklus mit dem Wirtsorganismus. Bei pathogenen Erregern führt dies in der Regel zu Krankheitserscheinungen im jeweiligen Wirt. Die Erforschung der molekularen Mechanismen der Virus-Wirt-Interaktion kann helfen, die Pathogenese von Viruserkrankungen aufzuklären und Therapeutika zur Behandlung von Virusinfektionen zu entwickeln. Die vorliegenden Arbeiten beschäftigen sich mit der Virus-Wirt-Interaktion von RNA-Viren, die den Respirationstrakt und/oder den Intestinaltrakt als Eintrittspforte für eine Infektion nutzen.

Für die bovinen Paramyxoviren BRSV und BPIV-3 sowie für aviäre und porzine Influenzaviren wurde der Viruseintritt mit Präzisionslungenschnitten (PCLS) vom Rind bzw. Schwein und bovinen Air-Liquid-Interface-Kulturen untersucht. BPIV-3 und die Influenzaviren infizierten bevorzugt zilientragende Epithelzellen. BRSV konnte nur in tieferen Gewebsschichten der Bronchioli nachgewiesen werden. Das aviäre Influenzavirus H7N7 infizierte zusätzlich zu den Epithelzellen submukosale Zellen. Das aviäre H9N2 Influenzavirus konnte sich in porzinen PCLS zu Titern replizieren, die nur ein Zehntel unter denen des porzinen H3N2 lagen. Dies weist auf ein hohes Potential zur Adaptation an das Schwein als neuen Wirt hin.

Die Coronaviren TGEV und IBV interagieren mit Sialinsäuren auf der Zelloberfläche. Die Sialinsäurebindungseigenschaft des porzinen Coronavirus bewirkte eine effiziente Virusanheftung an die Zelle. Dies stellt unter ungünstigen Vermehrungsbedingungen einen Replikationsvorteil dar. Im Gegensatz zu TGEV war die Infektiösität von IBV grundsätzlich sialinsäureabhängig. Hier scheinen Sialinsäuren als genereller Faktor für die primäre Anheftung an die Zielzelle von Bedeutung zu sein. Die Effizienz einer TGEV-Infektion war ebenfalls vom Cholesteringehalt der Zell- und der Virusmembran abhängig. Hier spielt das Cholesterin in einem post-adsorptiven Schritt eine Rolle, indem vermutlich durch eine Umsortierung der Virus- und Zellmembranen der Viruseintritt erleichtert wird. Die Entwicklung eines VSV-basierten Pseudotypensystems ermöglichte es, den Viruseintritt des SARS-CoV und seine Cholesterinabhängigkeit zu untersuchen. Der zelluläre Rezeptor ACE2 lag in cholesterinhaltigen Mikrodomänen in der Zellmembran vor. Dies fördert möglicherweise eine multivalente Interaktion von ACE2 mit den SARS-CoV S-Proteinen, welche einen Replikationsvorteil für das Virus darstellt. Neben der Abhängigkeit des coronaviralen Viruseintritts von Sialinsäuren und Cholesterin wurde in den vorliegenden Arbeiten der Transport und die Lokalisation coronaviraler S-Proteine untersucht. Das TGEV S-Protein und das IBV S-Protein wurden aufgrund eines tyrosin-basierten Sortierungssignals in der Nähe des ERGIC, dem Knospungskompartiment der Coronaviren, zurückgehalten. Das SARS-CoV S-Protein wurde zur Plasmamembran transportiert. Mutationen im TGEV S-Protein stromabwärts des tyrosin-basierten Sortierungssignals zeigten, dass auch Aminosäuren außerhalb dieses Motivs den Proteintransport beeinflussen können. Mit Hilfe eines genomweiten Yeast-2-Hybrid-Screens wurde Cyclosporin A als coronaviraler Inhibitor identifiziert. Der Calcineurin/NFAT Signalweg wurde indirekt durch eine Komplexbildung von Cyclosporin A mit Cyclophilinen gehemmt. Durch diese Cyclophilininhibierung kam es zu einer genusübergreifenden Blockade der Coronavirusreplikation.

 

Summary

Viruses interact with their hosts during replication. By studying the molecular mechanisms of virus-host interactions the pathogenesis of viral diseases can be elucidated and new therapeutic agents can be developed. This work analyzed the virus-host interaction of RNA viruses that infect the host via the respiratory and/or the gastrointestinal route.

For the bovine paramyxoviruses BRSV and BPIV-3 as well as for avian and porcine influenza viruses virus entry was analyzed by using precision cut lung slices (PCLS) of the bovine and porcine lung and bovine air-liquid-interface cultures. BPIV-3 and influenza viruses infected preferentially ciliated cells. Infection by BRSV was observed in cells located in lower cell layers of PCLS. H7N7-infected cells were not only detected in the epithelium but also in submucosal cell layers. H9N2 grew to titers that were only tenfold lower than that of the tested porcine H3N2 virus. This avian virus seems to be an interesting candidate for interspecies transmission.

The coronaviruses TGEV and IBV interact with sialic acids on the cell surface. The sialic acid binding activity of the porcine coronavirus led to an efficient virus attachment. In this way, infection by TGEV is facilitated under unfavorable environmental conditions. Infection by IBV was strictly sialic acid dependent. Binding to sialic acids is used by IBV for primary attachment to the cell surface. In addition, efficient infection by TGEV was dependent on the cholesterol content of the viral and the cellular membrane. Cholesterol was shown to be important for a post-adsorption step, allowing membrane rearrangements that facilitate virus entry.

Vesicular stomatitis virus was pseudotyped with the SARS-CoV S protein and used for the analysis of SARS-CoV entry and its dependance on cholesterol. The cellular receptor ACE2 was present in cholesterol-rich membrane microdomains. This clustering of ACE2 may allow multivalent binding of virus particles to the cell surface which leads to an increase in infection efficiency. In addition to coronavirus entry and its dependance on sialic acids and cholesterol, the transport and localization of coronavirus S proteins was analyzed. The TGEV S and the IBV S protein were retained near the ERGIC – the budding compartment of coronaviruses – due to a tyrosine-based sorting signal. The SARS-CoV S protein was transported to the plasma membrane. Site-directed mutagenesis in the TGEV S protein showed that amino acids downstream of the tyrosine-based sorting signal may influence the protein transport. A genome-wide yeast-two hybrid interaction screen was used to identify cyclosporin A as coronaviral inhibitor. The Calcineurin/NFAT pathway was inhibited due to complex formation of cyclosporin A with cyclophilins. Due to this inhibition of cyclophilins the replication of coronaviruses of all genera was blocked.

 

keywords

RNA-Viren, Viruseintritt, Transport von Virusproteinen, RNA viruses, virus entry, viral protein transport

kb

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