HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Anke Schnapper

 

Direkte Zell-Zell-Interaktionen während der

Wachstums- und funktionell-adaptiven

Reifungsvorgänge im Skelett des Hundes

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2356

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2007

text

/dissertations/h_schnapper07.pdf

Englischer Titel

Direct cell-cell interactions during growth and functional-adaptive maturation processes in the skeleton of the dog

Zusammenfassung

Die Koordination der Zellaktivität stellt eine entscheidende Voraussetzung für ein geordnetes Skelettwachstum einschließlich der damit verbundenen Reifungsprozesse dar. Im Rahmen der direkten Zell-Zell-Interaktionen sind hierfür gap junctions und adherens junctions verantwortlich, die jeweils aus spezifischen Zellmembranproteinen, den Connexinen und Cadherinen, zusammengesetzt sind. Ihre Beteiligung an der postnatalen Skelettentwicklung des Hundes wurde an Humerus, Skapula und Lendenwirbeln von 6 Wochen, 13 Wochen und 5 Monate alten Beaglewelpen sowie adulten Beagles untersucht. Die entnommenen Proben enthielten jeweils Anteile der Diaphysen sowie aller Epi- und Apophysen mit ihren jeweiligen Epi- bzw. Apophysenfugen. Zur Analyse der strukturellen Veränderungen an den Skelettelementen während des Wachstums wurden mikrofokus-radiographische, histomorphologische, polarisationsmikroskopische und morphometrische Untersuchungen sowie eine 3-D-Rekonstruktion durchgeführt. Der Nachweis der Zell-Zell-Interaktionsmoleküle erfolgte immunhistochemisch (Connexine und Cadherine) sowie ergänzend durch in situ Hybridisierung (Connexine).

Humerus: Der Knochenkern füllte mit 6 Wochen etwa die kaudale Hälfte der proximalen Epiphyse aus. Das Tuberculum majus und die restlichen Anteile des Caput humeri bestanden aus Cartilago epiphysalis mit großen hypertrophen Bereichen in der Peripherie des Ossifikationszentrums. Im Alter von 5 Monaten nahm der Knochenkern die gesamte Epiphyse ein, und sein Wachstumsabschluss begann zentral am Caput humeri mit der Ausbildung einer subchondralen Knochenplatte und der vollständigen Differenzierung des Gelenkknorpels. Die distale Humerusepiphyse enthielt mit 6 Wochen die Ossifikationszentren von Capitulum und Trochlea humeri; bis zur 13. Woche kam der Apophysenkern des Epicondylus medialis hinzu. Mit 5 Monaten waren alle drei Ossifikationszentren verschmolzen und an der gesamten Gelenkfläche des Condylus humeri war das Wachstum abgeschlossen. Während die proximale Epiphysenfuge bei Welpen aller Altersgruppen voll entwickelt war, ging sie distal mit 5 Monaten in Regression über. Die Gesamtbreite der Epiphysenfugen sank proximal von 0,86 mm (6 Wochen) auf 0,68 mm (5 Monate) und distal im gleichen Alter von 1,19 mm auf 0,36 mm, wobei die Unterschiede in erster Linie durch verschieden breite Reservezonen bedingt waren. Die Fuge zwischen den Knochenkernen des Capitulum und der Trochlea humeri stellte ein Residuum von Cartilago epiphysalis dar. Den gleichen Aufbau zeigte die Fuge zwischen der Trochlea humeri und dem Epicondylus medialis, während der zur Diaphyse gerichtete Apophysenfugenanteil Cartilago physalis enthielt. Der Übergang von den Extremitates zum Corpus humeri war durch ausgeprägte Modellierungsregionen (Collum humeri, Foramen supratrochleare) mit zahlreichen, subperiostalen Osteoklasten gekennzeichnet. Bereits bei den 6 Wochen alten Welpen war eine geringgradige, trajektorielle Ausrichtung der Spongiosa vorhanden. Ihre Hauptorientierungsrichtungen wandelten sich schon bis zum Alter von 13 Wochen deutlich. Nach dem Epiphysenfugenschluss verstärkte sich die Anisotropie und es fand eine tiefgreifende Rekonstruktion der Spongiosaarchitektur statt. Die Kompakta des Corpus humeri enthielt bei den 6 Wochen alten Hunden laminar bone. Durch seine 3-D-Rekonstruktion wurde sichtbar, dass er aus parallelen, kontinuierlichen Knochenplatten mit longitudinal-zirkulärer Ausrichtung bestand, die durch bälkchenförmige Knochenbrücken miteinander verbunden waren.

Die Skapulaplatte wuchs am Margo cranialis und Margo caudalis sowie am Rand der Spina scapulae durch periostale Ossifikation. Zusätzlich wiesen die 6 Wochen alten Beagles am Margo caudalis eine Zone mit enchondraler Ossifikation auf. Die Cavitas glenoidalis wurde von einem relativ breiten Streifen aus Knorpelgewebe (bis zu 1,5 mm) gebildet. Dieses grenzte mit einer Wachstumsfuge an den Skapulakörper, die morphologisch einer Epiphysenfuge glich. Im Tuberculum supraglenoidale begann mit 6 Wochen die Entstehung des sekundären Ossifikationszentrums, das mit 13 Wochen voll ausgebildet war und mit 5 Monaten mit dem Skapulakörper verschmolz.

Entsprechend der Verteilung der Knorpelgewebstypen stellte sich die Cavitas glenoidalis als schmale, distale Epiphyse der Skapula dar, die nur im Tuberculum supraglenoidale einen kleinen Epiphysenkern enthielt.

Das Corpus vertebrae der Lendenwirbel zeigte bei den 6 und 13 Wochen alten Welpen intensives Wachstum des Epiphysen- und Epiphysenfugenknorpels, der Epiphysenkerne sowie enchondral und periostal an der Diaphyse. Die Epiphysenfugenbreite lag mit 6 Wochen bei 0,66 mm und mit 5 Monaten bei 0,36 mm. Mit 5 Monaten war das Wachstum der Epiphysenkerne zur Wirbelendplatte abgeschlossen. Die Epiphysenfugen wiesen im gleichen Alter erste Anzeichen einer Regression auf.

In Abhängigkeit von der Lokalisation und dem Alter waren in der Kompakta bzw. Kortikalis aller drei untersuchten Skelettelemente unterschiedliche Knochengewebstypen anzutreffen: Geflechtknochen, einfacher und segmentierter Lamellenknochen und primäre Osteone. Ab dem Alter von 5 Monaten befanden sich in der Humeruskompakta und der Kortikalis der Skapula auch sekundäre Osteone. Darüber hinaus war in der Humeruskompakta (6 Wochen) und an der Basis der Spina scapulae (13 Wochen) laminar bone vorhanden. Dagegen bestand die Spongiosa mit wenigen Ausnahmen in allen Altersgruppen aus einfachem oder segmentiertem Lamellenknochen, auch in der primären Spongiosa wurde direkt Lamellenknochen gebildet.

In den Zellpopulationen des Knochen- und Knorpelgewebes wurde die Expression der Connexine (Cx) 26, 30, 31, 32, 43 und 45 untersucht. In Osteoblasten konnten Cx26, 30, 32 und 43 nachgewiesen werden. Bei der Transformation zu bone lining cells ging Cx43 verloren, während Osteozyten nur noch Cx26 (inkonstant) und Cx32 enthielten. Osteoklasten exprimierten Cx26, 30, 32 und 43. In Chondrozyten des epiphysären Reserveknorpels sowie der physalen Reservezone waren keine der untersuchten Connexine nachweisbar. Dagegen reagierten hypertrophe Chondrozyten der Cartilago epiphysalis positiv auf Cx26, 31 und 32. Im Epiphysenfugenknorpel exprimierten die Chondrozyten ab der Proliferationszone Cx26 und ab der hypertrophen Zone zusätzlich Cx32.

Bei den Untersuchungen zur Expression der Cadherine (CDH) E-, N-, P- VE- und 11 fanden sich in Osteoblasten vier adherens junction-Moleküle (E-, N-, P-CDH und CDH11). Bone lining cells und Osteozyten exprimierten N-CDH und CDH11, während in Osteoklasten wiederum alle untersuchten Cadherine nachweisbar waren.

In der Cartilago epiphysalis blieben die Reservechondrozyten negativ, die hypertrophen Chondrozyten reagierten dagegen positiv auf N- und P-CDH. In der Cartilago physalis wurde CDH11 von der Proliferationszone bis zum Blasenknorpel exprimiert.

Eine positive Reaktion auf E- und N-CDH war von der Proliferationszone bis zur hypertrophen Zone vorhanden, wobei die stärkste N-CDH-Reaktivität in der Proliferationszone und die kräftigste E-CDH-Reaktivität in der hypertrophen Zone auftrat. Bei der Regression der Epiphysenfugen ging die CDH11-Expression verloren, stattdessen erfolgte eine Expression von P-CDH.

Sowohl bei den Connexinen als auch bei den Cadherinen waren häufig lokalisationsabhängige Unterschiede in der Reaktionsintensität zu beobachten. Dies betraf vor allem die Expression in Osteoblasten und Osteoklasten.

Aus den ermittelten Expressionsmustern wurde jeweils ein Konzept für die Mechanismen der Zell-Zell-Interaktion über gap junction-Kanäle bzw. adherens junctions in den Kompartimenten des Knochenaufbaus, des ruhenden Knochens und des Knochenabbaus sowie des Epiphysen- und Epiphysenfugenknorpels erstellt.

Anhand dieser Konzepte wurden die möglichen funktionellen Konsequenzen der gap junction- und adherens junction-Kommunikation im Knochen- und Knorpelgewebe diskutiert. Schließlich erfolgte eine Verknüpfung der Ergebnisse der strukturellen Analyse mit denen der Zell-Zell-Interaktionen.

 

Summary

Coordination of cellular activities is an essential prerequisite for proper skeletal growth including associated maturation processes. Among the types of direct cellcell- interactions, gap junctions and adherens junctions are responsible for this coordination. They are composed of specific transmembrane proteins, connexins and cadherins, respectively. Their involvement in the postnatal skeletal development of the dog was studied in humerus, scapula and lumbar vertebrae of 6 week, 13 week and 5 month old beagle puppies and adult beagles. The samples comprised parts of the diaphyses and of all epi- and apophyses including the respective growth plates.

Microfocus-radiography, histomorphology, polarisation microscopy, 3-Dreconstruction and morphometry were performed to analyze the structural changes of the growing skeletal elements. The expression of cell-cell-interaction molecules was studied immunohistochemically (connexins and cadherins) and additionally by in situ hybridisation (connexins).

Humerus: Approximately the caudal half of the proximal epiphysis was occupied by the secondary ossification centre at the age of 6 weeks,. The tuberculum majus and the remaining parts of the caput humeri consisted of cartilago epiphysalis which contained large hypertrophic areas at the periphery of the ossification centre. At the age of 5 months, the ossification centre took up the whole epiphysis. Centrally at the caput humeri, its growth had finished as indicated by formation of a subchondral bone plate and complete differentiation of the articular cartilage. The distal epiphysis of the humerus contained the ossification centres of the capitulum and trochlea humeri at the age of 6 weeks. Until the 13th week, the apophyseal ossification centre of the epicondylus medialis was formed. At the age of 5 months, all three ossification centres had fused, and the whole humeral condyle had completed its growth towards the articular facet. While the proximal growth plate was fully developed in all age groups, the distal one started regressing at the age of 5 months. The total width of the proximal growth plate decreased from 0.86 mm (6 weeks) to 0.68 mm (5 months) and distally from 1.19 mm to 0.36 mm (at the same age). The differences in width were primarily due to different widths of the reserve zones. The cartilage plate between the ossification centres of the capitulum and trochlea humeri was rather a residuum of epiphyseal cartilage. The same was true of the cartilage plate between the trochlea humeri and the medial epicondyle. In contrast, the apophyseal growth plate contained physeal cartilage towards the diaphysis. Transition from the epiphyses to the corpus humeri was characterized by intensive modelling activities (collum humeri, foramen supratrochleare) with numerous subperiosteal osteoclasts. Already in 6 week old puppies, some trajectorial alignment of the spongiosa existed. The primary directions of trabecular orientation already changed until the age of 13 weeks. After fusion of the growth plates, anisotropy increased and a profound reconstruction of the trabecular network occurred. In 6 week old puppies, the compact bone of the corpus humeri contained laminar bone. In the 3-D-reconstruction, it became visible that laminar bone consisted of parallel, continuous bone plates with longitudinal and circular orientation. They were connected by trabecula-like osseous bridges.

The plate of the scapula grew by periosteal ossification at its cranial and caudal border and the margin of the spina scapulae. Additionally, there was a zone of endochondral ossification at the margo caudalis in 6 week old beagles. The glenoid cavity was formed by a lining of cartilage tissue which was quite wide (up to 1.5 mm). A growth plate was found at the border towards the bony body of the scapula. It was morphologically identical with physeal cartilage. In the tuberculum supraglenoidale, a secondary ossification centre started to form at the age of 6 weeks. It was fully developed at the age of 13 weeks and fused with the body of the scapula at the age of 5 months. Regarding the distribution of the cartilage types, the glenoid cavity represented a narrow, distal epiphysis of the scapula, which contained a small epiphyseal ossification centre only inside the supraglenoid tuberosity.

The corpus of the lumbar vertebrae showed intensive growth of epiphyseal cartilage, physeal cartilage, epiphyseal ossification centres plus endochondrally and periosteally at the diaphysis. The width of the growth plates was 0.66 mm at the age of 6 weeks and 0.36 mm at the age of 5 months. The epiphyseal ossification centres had finished their growth towards the vertebral end plate in 5 month old dogs. At the same age, the growth plates showed first signs of regression.

Depending on the localization and age, different types of bone tissue were found in compact/cortical bone of all three skeletal elements: woven bone, simple and segmented lamellar bone and primary osteons. Starting at the age of 5 months, also secondary osteons were formed in compact bone of the humerus and cortical bone of the scapula. Furthermore, laminar bone was encountered in the humerus shaft (6 weeks) and the base of the spina scapulae (13 weeks). In contrast, spongy bone contained simple or segmented lamellar bone in all age groups (with few exceptions). Even in primary spongiosa, lamellar bone was formed.

The expression of connexins (Cx) 26, 30, 31, 32, 43 and 45 was studied in the cell populations of bone tissue and cartilage tissue. Cx26, 30, 32 and 43 were found in osteoblasts. During transformation to bone lining cells, Cx43 was lost while in osteocytes only Cx26 (inconstant) and Cx32 could be demonstrated. Osteoclasts expressed Cx26, 30, 32 and 43. No connexins were found in epiphyseal reserve chondrocytes. On the other hand, hypertrophic chondrocytes in epiphyseal cartilage reacted positively for Cx26, 31, and 32. In physeal cartilage, the expression of Cx26 started in the proliferative zone. An additional expression of Cx32 became obvious from the hypertrophic zone onwards. Studying the expression of the cadherins (CDH) E-, N-, P-, VE- and 11, four adherens junction molecules were found in osteoblasts (E-, N-, P-CDH and CDH11). Bone lining cells and osteocytes expressed N-CDH and CDH11. Again all of the studied CDH-subtypes could be demonstrated in osteoclasts. In epiphyseal cartilage, reserve chondrocytes remained negative, but hypertrophic chondrocytes reacted positively for N- and P-CDH. CDH11 was expressed from the proliferative zone to the calcifying zone of physeal cartilage. A positive reaction for E- and N-CDH was encountered in the proliferative and hypertrophic zone. The strongest N-CDH reactivity occurred in the proliferative zone but the strongest E-CDH reactivity was found in the proliferative zone. During regression of the growth plates, CDH11 was lost and P-CDH was expressed instead. Between different skeletal locations, variations in reaction intensity could be seen often for both connexins and cadherins, in particular in osteoblasts and osteoclasts.

From the expression profiles, concepts regarding the mechanisms of cell-cell-interaction via gap junction channels or adherens junctions were developed for the compartments of bone formation, resting bone and bone resorption as well as for epiphyseal cartilage and physeal cartilage. Possible functional consequences of gap junction and adherens junction communication in bone and cartilage tissue were discussed on the basis of these concepts. Finally, the results of the structural analyses and the cell-cell-interactions were connected with each other.

 

keywords

Skelettentwicklung, Connexine, Cadherine, skeletal development, connexins, cadherins

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