HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Martin Runge

 

MOLEKULARE, PHYLOGENETISCHE UND FUNKTIONELLE ANALYSE

MYKOPLASMALER HITZESCHOCKPROTEINE UND UNTERSUCHUNGEN ZU DEREN

EINFLUSS AUF DIE IMMUNANTWORT UND PATHOGENESE VON MYKOPLASMOSEN

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2267

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2003

text

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Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst Hitzeschockproteine (Hsp) und Hspkodierende Gene von Mykoplasmen identifiziert und charakterisiert. Die Untersuchungen wurden an den veterinär- bzw. humanmedizinisch relevanten Spezies Mycoplasma (M.) arthritidis, M. bovis, M. hyopneumoniae und M. pneumoniae durchgeführt. Aufgrund der in der Literatur beschriebenen besonderen Bedeutung in der Pathogenese bakterieller Infektionserkrankungen wurde der Schwerpunkt der Untersuchungen auf das 60 kDa-Hsp gelegt.

Nach Ermittlung der Temperaturtoleranz wurden die einzelnen Mykoplasmenspezies einem Hitzeschock ausgesetzt. Dabei zeigte sich eine gesteigerte Synthese von verschiedenen Proteinen, die sich aufgrund ihrer Molekulargewichte den Hsp60-, Hsp70- und Hsp90-Familien zuordnen ließen. Durch Behandlung der Mykoplasmen mit Wasserstoffsuperoxid konnten keine Stressproteine induziert werden. Die Hsp60- und Hsp70-homologen Proteine wurden durch Westernblot-Analysen nach ein- und zweidimensionaler Gelelektrophorese hinsichtlich ihrer Molekulargewichte und isoelektrischen Punkte charakterisiert. Von M. arthritidis und M. bovis wurden die Hsp60 durch eine Kombination von Kationenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie isoliert, aufgereinigt und auf ihre ATPase-Aktivität untersucht.

Dabei konnte eine mit den Hsp60 von anderen Bakterienspezies und von Eukaryonten vergleichbare ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Das aufgereinigte Hsp60 von M. arthritidis wurde in nachfolgenden Untersuchungen als Antigen in einem ELISA eingesetzt.

In die Analyse der hsp60-Gene wurde die Spezies M. agalactiae aufgrund der engen Verwandtschaft zu M. bovis einbezogen. Die Sequenzierung der hsp60-Gene von M. agalactiae, M. arthritidis, M. bovis und M. hyopneumoniae erfolgte auf der Basis von PCR-Fragmenten. Die Sequenzen der als Primer verwendeten Oligonukleotide wurden durch Vergleich bereits bekannter hsp60-Gene von M. pneumoniae, M. genitalium, Clostridium (C.) perfringens, Bacillus (B.) subtilis und E. coli ermittelt.

Über die Gesamtgenlänge wurde eine Sequenz von 1600 bp abgedeckt. Die hsp60- Sequenzen der untersuchten Mykoplasmenspezies wiesen untereinander und mit dem hsp60-Gen von M. pneumoniae Homologien von 98,0 bis 99,9 % auf. Mit dem hsp60-Gen von M. genitalium betrug die Homologie lediglich 76,5 bis 77,7 %. Die Homologien der hsp60-Sequenzen der verschiedenen Mykoplasmenspezies mit C. perfringens, B. subtilis und E. coli lagen abhängig von der phylogenetischen Stellung zu den Mykoplasmen zwischen 59,7 und 49,2 %.

Zusätzlich wurden hsp70-Genfragmente untersucht. Zur Amplifikation wurden degenerierte Primer eingesetzt, die auf der Basis eines hochkonservierten Bereiches des hsp70-Gens von C. perfringens generiert wurden. Es wurde ein ca. 600 bp großes Fragment abgedeckt. Die Sequenzanalyse ergab innerhalb der Mykoplasmen sehr unterschiedliche Homologien von 46,8 bis 51,3 % zwischen M. pneumoniae, M. genitalium und M. capricolum und bis zu 99,8 % zwischen M. arthritidis und M. bovis. Die Homologien mit den hsp70-Genen der anderen Bakterien betrugen abhängig vom Verwandschaftsgrad 53,2 bis 60,5 %.

Bei Vergleich der von den Basensequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab bei den Mykoplasmen für die Hsp60-Peptide Homologien von 90,4 bis 99,9 %, für das Hsp70-Peptid Homologien von 63,2 bis 98,9 %. Die Homologien mit anderen Bakterienspezies betrugen 53,2 bis 60,8 % für die Hsp60-Peptide und 58,7 bis 68,5 % für das Hsp70-Peptid. Die Konservierung der Aminosäuresequenzen war im N-terminalen und mittleren Bereich des Hsp60 am höchsten. In den Hsp60 der untersuchten Mykoplasmenspezies konnten 17 bis 22 potentiell antigene Bereiche ermittelt werden, die fast ausschließlich in stark konservierten Proteinregionen lokalisiert waren. In den Hsp70-Peptiden wurden 10 bis 12 potentiell antigene Bereiche festgestellt.

Anhand der Basensequenzen und der von diesen abgeleiteten Aminosäuresequenzen der hsp70-Fragmente konnte die auf 16S rRNA-Analysen beruhende phylogenetische Einteilung der Mykoplasmen bestätigt werden. Zudem konnten die sehr nahe verwandten Spezies M. bovis und M. agalactiae eindeutig unterschieden werden. Die Analyse des Hsp70 stellt damit eine sehr erfolgversprechende Ergänzung zu den bisher verwendeten 16S rRNA-Analysen dar.

Zur Klärung der Frage, ob mykoplasmale Hsp vom Immunsystem erkannt werden und, ob sie in Immunreaktionen eingreifen, wurden rekombinante Hsp60 und Hsp70 als Fusionsproteine mit Gluthation-S-Transferase hergestellt. Diese zeigten im Westernblot mit Seren von Rindern und Schweinen, die im ELISA hohe Antikörpertiter gegen M. bovis bzw. M. hyopneumoniae aufwiesen, eine starke Reaktion, während ELISA-negative Seren nicht oder nur sehr schwach reagierten.

Ein Einfluß des mykoplasmalen Hsp60 auf das Immunsystem wurde in vitro durch Stimulation von Makrophagenzellinien nachgewiesen. Mit einem rekombinanten Fusionsprotein, das dem carboxyterminalen Teil des Hsp60 entspricht, wurde eine deutlich gesteigerte Sekretion der Zytokine IL-1ß und IL-6 induziert.

Ob bakterielle Hsp im Verlauf einer Infektion eine Rolle spielen, wurde an einem in vitro Modell, und zwar an der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) von mit M. hyopneumoniae infizierten Schweinen, untersucht. Hierfür wurde M. hyopneumoniae mit BALF von M. hyopneumoniae-infizierten und nicht mit M. hyopneumoniae infizierten Schweinen inkubiert. Die Veränderung im Proteinspektrum der Mykoplasmen wurde in der ein- und zweidimensionalen Gelelektrophorese und nach Westernblot mit Antiseren gegen Hsp60 untersucht. Bei unbehandelten Mykoplasmen und mit BALF nicht infizierter Schweine inkubierten Mykoplasmen wurde eine Basiskonzentration an Hsp60 nachgewiesen. Bei den mit BALF infizierter Schweine behandelten M. hyopneumoniae-Zellen war demgegenüber die Konzentration des Hsp60 um das fünffache erhöht. Offensichtlich sind in der BALF Faktoren vorhanden, die einen Einfluß auf die Proteinexpression von M. hyopneumoniae ausüben.

Für die Untersuchungen zum Einfluß von Hsp auf die Pathogenese einer Erkrankung wurde als Tiermodell die M. arthritidis-Polyarthritis der Ratte gewählt, nachdem in Westernblot-Analysen Kreuzreaktionen zwischen mykoplasmalen und eukaryontischen Hsp nachgewiesen worden waren. Die Ratten wurden mit den rekombinanten Fusionsproteinen immunisiert und danach mit einem hoch virulenten Stamm von M. arthritidis infiziert. Bei den meisten der mit Hsp60 immunisierten Ratten war der Krankheitsverlauf deutlich milder, als bei den nicht immunisierten Tieren der Infektionskontrolle und den mit dem rekombinanten Hsp70 immunisierten Tieren. Die pathohistologischen Befunde stimmten mit dem klinischen Bild überein.

Der durch die Immunisierung mit den rekombinanten Hsp60 erzielte protektive Effekt stellt einen erfolgversprechenden Ansatz für die Entwicklung von Vakzinen dar.

keywords

Mykoplasmen, Hitzeschockproteine, Pathogenese, mycoplasma, heat shock protein, pathogenesis

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