HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Hugo Istvan Murua Escobar

 

Structural and functional analyses of canine genes for the establishment of therapeutic approaches in oncology

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2539

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2011

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_muruaescobar11.pdf

abstract (deutsch)

Die hier vorgelegte Arbeit ist im Bereich der Grundlagenforschung mit Schwerpunkt in der vergleichenden Onkologie angesiedelt. Die eingeflossenen Arbeiten sind hauptsächlich in Zusammenarbeit zwischen Molekularbiologen und Veterinärmedizinern entstanden, mit dem Ziel, tumorrelevante canine Gene und Proteine strukturell und funktionell zu charakterisieren. Die gewonnenen Erkenntnisse sollten als Grundlage zur Erstellung therapeutischer Konzepte dienen, die sowohl dem humanmedizinischen als auch dem veterinärmedizinischen Patienten zu Gute kommen sollten. Diesem interdisziplinären Charakter folgend ist der Ansatz der Grundlagenforschung durch die Etablierung von neuartigen Methoden und dem Übergang zu in vivo Szenarien ergänzt worden. Es wurden beispielsweise thematische Bereiche wie klassische Gencharakterisierungen bearbeitet, als auch die Entwicklung neuartiger Methodiken vorangetrieben, wie etwa die laserbasierte Transfektion von eukaryontischen Zellen oder die Charakterisierung von DNA-Nanopartikel-Interaktionen. Diese interdisziplinären Ansätze wurden in Zusammenarbeit mit weiteren Fachrichtungen wie etwa der Humanmedizin, Physik und Chemie verfolgt.

Im Bereich der Grundlagenforschung sind verschiedene strukturelle und funktionelle Analysen zur Charakterisierung von humanen und caninen Genen und Proteinen wie etwa HMGA1, HMGA2, RAGE incl. Varianten, HMGB1, TNF-α, IL1-α, und IL1 durchgeführt worden.

Für das canine Prostatakarzinom sind zytogenetische Analysen durchgeführt und vergleichend zum humanen Gegenstück analysiert worden.

Weiterhin wurde HMGA2 als molekularer Marker charakterisiert und eine Korrelation zwischen Genexpression und malignem Potential der Gewebe beschrieben. Hiervon ausgehend ist eine HMGA-antisense Strategie über die Applikation von adenoassoziierten Viruspartikeln in vitro etabliert worden. Ergänzend wurde ein in vivo Modell für canine Prostatakarzinome in NOD-SCID Mäusen mit einer caninen Prostatakarzinomzelllinie etabliert und charakterisiert.

Zur Etablierung eines zelltherapeutischen Ansatzes mit gesteigertem immunstimmulatorischen Potential wurde eine Methodik entwickelt mit der, eukaryontische Zellen mittels Femtosekundenlaserbestrahlung mit DNA Expressionsplasmiden, codierend für das proinflammatorisch wirkende HMGB1 Gen, transfiziert werden können.

Hierzu wurde der canine Rezeptor (RAGE) für das HMGB1 Protein charakterisiert sowie diverse HMGB1 Expressionsplasmide konstruiert und deren Funktionalität verifiziert. Weiterhin wurden verschiedene Strategien zur Induzierung einer gerichteten HMGB1-Ausschüttung evaluiert sowie die induzierten Effekte auf Immunzellen charakterisiert.

Ergänzend ist die Interaktion zwischen laserabladierten Goldnanopartikeln und DNA-Expressionsplasmiden in vitro charakterisiert worden.

 

abstract (englisch)

The here presented work was set in the field of basic research in comparative oncology. The work initially enrolled in cooperation between geneticists and veterinary clinicians with the aim to characterise cancer related canine genes and proteins structurally and functionally and thus consequently the cellular mechanisms in which these genes and proteins take part. This effort was further developed and amplified with the goal to establish therapeutic approaches holding benefits for human and veterinary patients. Consequently, the projects shifted to interdisciplinary efforts dealing not only basic research, but adjoining with the establishment of methodologies and in vivo animal models.

Thus, this work composes of parts located in basic research as e.g. gene characterisations as well as the development of methodologies such as laser transfections and DNA nanoparticle interactions. In total the followed goals were approached in an interdisciplinary cooperation involving e.g. clinicians, cell and molecular biologists, physicists, and chemists.

In terms of basic research several structural and functional analyses were performed characterising cancer related human and canine genes and proteins, such as HMGA1, HMGA2, RAGE and its variants, HMGB1, TNF-α, IL1-α, and IL1-β.

For canine prostate cancer, cytogenetic analyses revealed structural and numerical aberrations which are also found in their human counterpart. Further HMGA2 was characterised and established as molecular marker showing a correlation between expression level and malignant potential. Based on these data, the basis for a gene therapeutic approach was established using HMGA-antisense AAVs for the inhibition of prostate cancer cell proliferation. Additionally, an in vivo model for canine prostate cancer was established using a canine prostate cancer cell line and by characterising its in vivo behaviour in NOD-SCID mice as biological model. Summarising this, an in vivo model for canine prostatic cancer was established, characterised on cell and molecular genetic level, and the basis for a therapeutic approach was set.

The second major topic focussed on the design of an immunotherapeutic approach using the laser based transfection of cells with DNA expression plasmids coding for the proinflammatory acting HMGB1 and their latter application as cellular vaccines. For this purpose, the canine receptor of HMGB1 named RAGE was characterised, several HMG expression plasmids constructed and transfected into several cell types. The functionality of these plasmids was characterised as well as the functionality of the respective coded proteins. The mechanisms for a stimulated HMGB1 protein release were characterised, as well as the effect of HMGB1 on canine immune related cells. Further, a fs laser based method for the transfection of mammalian cells was established allowing the transfection of primary and stem cells. This project was completed by the characterisation of effects induced by coincubation and transfection of laser ablation generated nanoparticles and DNA expression plasmids. These work packages are currently ongoing and being expanded to the characterisation of the induced effects in vivo.

 

keywords

Onkologie, Kleintiere, Gene; oncology, dog, genes

kb

6.953