HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Köckritz-Blickwede, Maren von

 

Die Bildung von extrazellulären DNANetzen in der Immunabwehr gegen bakterielle Infektionen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2679

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_koeckritz-blickwede14.pdf

Zusammenfassung

Die Bildung von extrazellulären DNA-Netzen wurde im Jahr 2004 als ein neuer Immunabwehrmechanismus gegen Infektionen bekannt und hat das klassische Konzept der Immunabwehr durch Phagozyten erweitert. Wohingegen bisher angenommen wurde, dass Zellen der angeborenen Immunabwehr wie Neutrophile, Makrophagen, oder Mastzellen infektiöse Erreger durch intrazelluläre Aufnahme und Abtöten, der sogenannten Phagozytose, eliminieren, wurde mit der Bildung der DNA-Netze ein weiterer Phagozytose-unabhängiger Mechanismus beschrieben. Die Zellen werfen ein Netz an Kernmaterial bestehend aus DNA und Histonen aus, und nutzen dieses DNA-Netz als Fangarme, um Mikroorganismen einzufangen und in einzelnen Fällen auch zu töten. Das Ziel dieser Forschungsarbeiten war es, die Rolle der DNA-Netze gegen bakterielle Infektionen genauer zu charakterisieren. Die folgenden Ziele standen im Fokus der Arbeit und wurden auf biochemischer und zellulärer Ebene untersucht:

(1)  Visualisierung und funktionelle Evaluierung von DNA-Netzen;

(2)  Untersuchung der Mechanismen, die zur DNA-Netz-Bildung führen;

(3)  Charakterisierung von bakteriellen Anti-DNA-Netz-Faktoren;

(4)  Charakterisierung von pharmakologischen Substanzen auf ihre Fähigkeit, DNA-Netz-Bildung zu verstärken oder DNA-Netze zu stabilisieren.

 

Als erster Schritt zur Verbesserung der Visualisierung der DNA-Netze konnte im Rahmen dieser Untersuchungen gezeigt werden, dass Serum, welches normalerweise als Bestandteil der Zellkultur genutzt wird, Nukleasen enthält, und DNA-Netze degradiert. Somit kann eine optimale Visualisierung und Analyse der DNA-Netz-Bildung gestört werden. Eine Hitzeinaktivierung des Serums bei 70°C ist nötig, um diese Nukleasen zu inhibieren und optimale Zellkulturbedingungen für die experimentelle Arbeit zu schaffen. Basierend auf einer verbesserten Technik zum Nachweis von DNA-Netzen konnten schließlich weitere Zelltypen identifiziert werden, die in der Lage sind, DNA-Netze auszubilden, wie z.B. Fibrozyten.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige wesentliche Mechanismen der DNA-Netz-Bildung charakterisiert: Zunächst wurde Hypochlorit (HOCl) als eine wichtige reaktive Sauerstoffspezies identifiziert, welches die DNA-Netz-Bildung in humanen Neutrophilen auslösen kann. Außerdem wurde ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der sogenannte Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF-1α) als Regulator in der zellulären Signalgebung der DNA-Netz-Bildung bei Mastzellen charakterisiert. Eine pharmakologische Verstärkung der Aktivität von HIF-1α sorgt schließlich auch für eine verbesserte antimikrobielle Aktivität verschiedener Wirtszellen gegen bakterielle Erreger. In einem Modell der sekundären Infektion mit Pneumokokken nach vorausgehender Influenza-A-Infektion im Mittelohr konnte zusätzlich gezeigt werden, dass unspezifische Antikörper der Gruppe IgA die DNA-Netz-Bildung verstärken.

Im dritten Teil wurden bakterielle Faktoren charakterisiert, die in der Lage sind, den Bakterien einen Schutz gegenüber der antimikrobiellen Aktivität der DNA-Netze zu bieten. Für die Gram-positiven Bakterien Methicillin-resistente Staphylococcus. aureus (MRSA) und Streptococcus suis wurden bakterielle Nukleasen analysiert, die in der Lage sind, DNA-Netze zu degradieren und dadurch die Bakterien vor dem Einfangen und der Wachstumshemmung durch DNA-Netze schützt. Für MRSA konnte sogar gezeigt werden, dass die Nuklease einen wesentlichen Einfluss auf den Infektionsverlauf in einem murinen Lungeninfektionsmodell hat: Mäuse, die mit einer nukleasedefizienten Mutante des MRSA USA 300 LAC-Stamms intranasal infiziert wurden, zeigten einen abgeschwächten Krankheitsverlauf im Vergleich zu Mäusen, die mit dem Nuklease-positiven Wildtyp infiziert wurden. Zusätzlich wurden die Stickstoffmonoxid-Synthase bei MRSA, sowie die Kapselbildung als DNA-Netz-Evasionsfaktoren bei S. pyogenes identifiziert. Basierend auf diesen Studien konnte somit auch eine protektive Wirkung der DNA-Netze gegen bakterielle Infektionserreger belegt werden.

Interessanterweise zeigte sich jedoch auch, dass die Ausbildung der DNA-Netze nicht nur eine protektive Wirkung für den Wirt haben kann. Bei einer sekundären Pneumokokken-Infektion nach vorausgehender Influenza-A-Infektion des Mittelohrs stellte sich heraus, dass die Pneumokokken die DNA-Netze nutzen, um sich zu vermehren. Ob letztendlich die DNA-Netze eine protektive oder möglicherweise auch schädliche Wirkung für den Infektionsverlauf aus Sicht des Wirtes darstellen, scheint von dem Erreger und auch dem Infektionsort abzuhängen. Im Falle einer protektiven Wirkung, wie für MRSA gezeigt, könnten die Netze einen attraktiven Angriffspunkt für therapeutische Ansätze liefern, indem man sie gegen Degradation durch Bakterien stabilisiert oder auch die Netzbildung an sich pharmakologisch verstärkt.

Schließlich wurden in dem letzten Teil dieser Arbeit drei verschiedene pharmakologische Substanzgruppen biochemisch und zellbiologisch auf ihre Fähigkeit getestet, ob sie die DNA-Netz-Bildung beeinflussen können. Zunächst zeigte sich, dass Statine, Inhibitoren der 3-Hydroxy 3-Methylglutaryl Coenzym A-Reduktase, das entscheidende Enzym der Cholesterol-Biosynthese, die Bildung von DNA-Netzen verstärken. Anhand biochemischer Untersuchungen konnte der Effekt der Statine einer Hemmung des Sterol-Stoffwechsels zugeordnet werden. In einem in vivo Mausmodell konnte sogar gezeigt werden, dass die orale Verabreichung von Statinen den Infektionsverlauf nach intranasaler Infektion mit Staphylococcus aureus protektiv beeinflusst: Die infizierten Mäuse, die mit Statinen gefüttert wurden, zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren eine verminderte Entzündung sowie geringere Bakterienzahlen in der Lunge. Neben den Statinen zeigte auch das Futterzusatzmittel β-Glucan, welches vor allem in der Fischzucht für ein verbessertes Wachstum und auch Immunstärke der Fische eingesetzt wird, eine Wirkung auf Fisch-DNA-Netze: Zunächst stimuliert β-Glucan die Ausbildung von DNA-Netzen und folglich auch das Einfangen von Fisch-pathogenen Bakterien wie Aeromonas hydrophila. Zusätzlich ist β-Glucan auch in der Lage, die DNA-Netze gegen eine Degradation durch Nukleasen von A. hydrophila zu stabilisieren. Als dritte pharmakologische Substanz konnte das Fluoroquinolon Enrofloxacin die Ausbildung von DNA-Netzen in bovinen Granulozyten verstärken. Biochemische Untersuchungen identifizierten die Rolle von zwei wesentlichen Enzymen, der Peptidyl-arginin-deiminase-4 und der NADPH-Oxidase, sowie des Zytoskeletts bei der Ausbildung dieser DNA-Netze. Diese Studien führen somit zu der Hypothese, dass bei bestimmten Erregern wie S. aureus und A. hydrophila eine pharmakologische Verstärkung der DNA-Netzbildung oder auch eine Stabilisierung der DNA-Netze für den infizierten Wirt vorteilhaft sein kann.

Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit wesentliche Erkenntnisse in Bezug auf die Rolle der DNA-Netze gegen bakterielle Infektionen gewonnen werden. Da sowohl protektive als auch negative Auswirkungen für den Wirt in Abhängigkeit des Infektionserregers beschrieben wurden, bleibt dennoch die Frage offen, ob DNA-Netze als Angriffspunkt für therapeutische Anwendungen dienen könnten. Dieses Thema wird in der übergreifenden Diskussion unter der Berücksichtigung aktueller Literatur diskutiert. Da eine überschüssige DNA-Netzbildung auch in Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen steht, scheint das Gleichgewicht zwischen DNA-Netz-Bildung und anschließender Eliminierung durch den Wirt ausschlaggebend für den Nutzen von DNA-Netzen oder einer Schädigung des Wirtes durch dieselben zu sein.

 

Summary

In 2004, the formation of extracellular DNA-traps (so-called neutrophil extracellular traps or NETs) was discovered as a novel host innate immune defense mechanism against infections. This discovery altered the fundamental conception of the innate immune defense mechanism of phagocytes against pathogenic microbes in a most fascinating way. Whereas it was believed that cells of the innate immunity as neutrophils, macrophages and mast cells kill the invading pathogens by intracellular uptake and subsequent killing, so-called phagocytosis, the discovery of formation of NETs revealed an additional phagocytosis-independent mechanism. The cells release an extracellular trap consisting of nuclear material as histones and DNA, which can be used to immobilize and occasionally also kill several bacteria, viruses or parasites. The aim of this study was to characterize the role of NETs against bacterial infections. The specific aims were:

(1)  Visualization and functional evaluation of NETs;

(2)  Investigation of the mechanisms leading to NET-formation;

(3)  Characterization of bacterial NET-evasion-factors;

(4)  Characterization of pharmacological agents, which have the ability to boost NET-formation or stabilize NETs against degradation.

 

As a first step to optimize the visualization of NETs, it was shown, that serum, which is normally used as supplemental factor in tissue culture, contains NET-degrading nucleases. Thus, the visualization and analysis of NETs could be hampered. Heat-inactivation of the serum at 70°C is necessary to inhibit the nucleases and to generate optimal tissue culture conditions for the NET-experiments. Based on an improved method for the detection of NETs, additional cell types, e.g. bone-marrow-derived fibrocytes, were identified to be able to release NETs.

In the second part of this work, some important mechanisms involved in the formation of NETs have been characterized: Firstly, hypochlorite (HOCl) was identified as the key reactive oxygen species involved in NET-formation of human neutrophils. Secondly, an important transcription factor, namely the hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α) was characterized as a regulator in cellular signaling events mediating NET-formation in mast cells. A pharmacological boosting of HIF-1α-activity was able to improve the antimicrobial activity of different host cells against bacterial pathogens. Thirdly, a model of secondary pneumococcal infections after prior influenza A infection demonstrated that non-specific IgA antibodies enhance the formation of NETs in the middle ear.

In the third chapter, bacterial factors that mediate resistance against antimicrobial effects of NETs were characterized. The Gram-positive bacteria methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Streptococcus (S.) suis showed production of bacterial nucleases, which are able to efficiently degrade NETs and to protect against NET-mediated inhibition of bacterial growth. In case of MRSA, it was demonstrated that the nuclease has a significant impact on the course of infection in a murine lung infection model: Mice that were intranasally infected with a nuclease-deficient mutant of the MRSA USA 300 LAC-strain exhibited an attenuated disease phenotype compared to mice infected with the nuclease-positive wild-type strain. Additionally, the bacterial nitric-oxide synthase of MRSA as well as the capsule of S. pyogenes were identified as NET-evasion factors. Based on these studies, the protective activity of NETs against several bacterial pathogens could be proven.

Interestingly, the formation of NETs does not only exhibit protective activity for the host. In case of a secondary pneumococcal infection after prior influenza A infection, it was found that the NETs facilitate survival and replication of pneumococci in the middle ear. Thus, it seems to depend on the pathogen and the place of infection if NETs have a protective or detrimental role for the host. In case of a protective role of NETs, as shown for MRSA, NETs could be used as a therapeutic target e.g. by pharmacologically boosting of NET-formation or stabilizing NETs against bacterial NET degradation.

In the last part of this study, three different pharmacological substance classes were biochemically and cell-biologically tested for their impact on NET-formation. First, statins, inhibitors of the 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A-reductase, the rate-limiting enzyme in cholesterol-biosynthesis, were shown to enhance NET-formation. Based on biochemical testing, the effect of statins was linked to the sterol pathway inhibition. Using an in vivo mouse model, it was also shown that the oral application of statins has a protective effect against intranasal infection with Staphylococcus aureus: The infected mice that were fed a diet containing statins showed a lower inflammation and lower bacterial load in the lung compared to respective control mice. Besides the statins, the feed-additive β-glucan, which is widely used in fish agriculture to improve growth and health status of fish, had an impact on NET-formation: On one hand, β-glucan was able to trigger NET formation and subsequently the entrapment of the fish pathogen Aeromonas hydrophila. On the other hand, β-glucan stabilized NETs against degradation by A. hydrophila nuclease. As a third pharmacological agent, the fluoroquinolone enrofloxacin enhanced formation of NETs in bovine granulocytes. Biochemical investigations identified two enzymes, the peptidyl-arginin-deiminase-4 and the NADPH-oxidase, as key enzymes involved in this process besides the cytoskeletal rearrangement. All these data may lead to the hypothesis that a pharmacological boosting of NET-formation or stabilization of NETs might improve the outcome of certain bacterial infections in the host.

In conclusion, this work provides important knowledge on the role of NETs against bacterial infections. Since protective as well as negative effects on the host were identified, the question still remains to be answered, whether NETs could be used as a novel target for therapeutic interventions. This topic is discussed within this thesis under consideration of the actual literature. Since an excessive release of NETs has been associated with detrimental consequences for the host e.g. autoimmune diseases, a fine balance between NET-formation and NET-degradation by the host itself seems to be essential for a final protective outcome of an infectious disease.

 

 

keywords

Infektionsbiochemie, Phagozyten, DANN-Netze, infection biochemistry, phagocytes, DANN-NETs

kb

4.118