HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Jemal Hussen

 

 

 Charakterisierung boviner Monozyten-Subpopulationen

 

Charechterisation of bovine monocyte subsets

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2845

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_hussen17.pdf

Zusammenfassung

Monozyten und ihre Abkömmlinge gelten als entscheidende Immunzellen der myeloiden Linie. Über die Interaktion mit anderen Immunzellen, vor allem den neutrophilen Granulozyten, sind sie an den verschiedenen Phasen der Entzündungsreaktion beteiligt. So sind funktionell unterschiedliche Monozyten- und Makrophagensubtypen nicht nur an der initialen Phase der Abwehr gegen invasive Krankheitserreger beteiligt, sondern sie tragen auch entscheidend zur Resolution einer Entzündung und zum Gewebeneubau bei. Die Monozyten- und Makrophagen-Heterogenität spielt bei zahlreichen Erkrankungen von Mensch und Maus eine bedeutende Rolle. Über die Heterogenität boviner Monozyten ist nichts bekannt und sollte daher in dieser Arbeit näher beleuchtet werden.

Folgende Ziele wurden definiert:

 

Bovine Monozyten-Subpopulationen sollten identifiziert und in reiner Form separiert werden.

Die Monozyten-Subpopulationen sollten phänotypisch und funktionell charakterisiert und ihre Interaktion mit bovinen neutrophilen Granulozyten untersucht werden.

Die Monozyten-Subpopulationen sollten darauf hin geprüft werden, in welche Makrophagensubtypen sie differenzieren.

 

Anhand ihrer Expressionsstärke des LPS-Rezeptors CD14 und des FcγRIII CD16 konnten bovine Blutmonozyten in drei Subpopulationen eingeteilt werden: klassische Monozyten (cM, CD14++CD16-), intermediäre Monozyten (intM, CD14++CD16+) und nicht-klassische Monozyten (ncM, CD14+CD16++). Basierend auf der Expressionsstärke der Oberflächenmoleküle CD14, CD16, CD172a, CD163 und MHC-Klasse-II sowie hinsichtlich der morphologischen Charakteristika waren bovine Monozyten-Subpopulationen den humanen Monozyten-Subpopulationen sehr ähnlich. Vergleichbar mit dem humanen System machten bovine cM den größten Anteil der Blutmonozyten aus (89 %), während die intM und ncM mit jeweils etwa 5‒10 % Minderheiten unter den Monozyten des Blutes darstellten.

 

Um die einzelnen Subpopulationen boviner Monozyten mit hoher Reinheit aus dem Blut zu separieren und diese anhand weiterer Analysen charakterisieren zu können, wurde eine MACS-Separationsmethode etabliert.

Funktionell erwiesen sich bovine cM und intM durch ihre stärkere Phagozytoseaktivität und ROS-Produktion als antimikrobielle Monozyten. Aufgrund ihrer Fähigkeit, nach ihrer Stimulation die höchste Menge an ROS-Metaboliten sowie das proinflammatorische Zytokin IL-1β zu sezernieren, wurden bovine intM als proinflammatorische Monozyten charakterisiert.

 

Für die Einwanderung von Monozyten ins Gewebe spielen verschiedene Adhäsionsmoleküle und Chemokinrezeptoren eine Rolle. In dieser Arbeit wurde daher das Expressionsmuster von Adhäsionsmolekülen auf bovinen Monozyten-Subpopulationen beschrieben. Bovine cM zeigten die stärkste Expression des Adhäsionsmoleküls L-Selektin, während die ncM die beiden Moleküle VLA-4 und LFA-1 am stärksten, die intM hingegen das Molekül PECAM-1 am höchsten exprimierten. Die Reaktionsfähigkeit auf das Chemokin CCL5 (RANTES) war zwischen den einzelnen Subpopulationen heterogen. So konnten nur bovine cM und intM auf das Zytokin CCL5 reagieren und in in vitro zur Migration angeregt werden.

 

Ein weiterer Teilaspekt dieser Arbeit prüfte die Interaktion boviner Monozyten-Subpopulationen mit neutrophilen Granulozyten (PMN). Dazu wurden Monozyten-Subpopulationen mit Degranulationsprodukten (DGP) von PMN in vitro stimuliert. Basierend auf dem induzierten Einstrom von Calcium erwiesen sich PMN-DGP als stimulierend für bovine cM und intM. Zudem induzierten PMN-DGP selektiv auf bovinen intM eine Hochregulation der Adhäsionsmoleküle PECAM1 und MAC1. Ebenso erwiesen sie sich in vitro als chemotaktisch für intM. Die Befunde deuten insgesamt darauf hin, dass PMN-DGP eine besondere Rolle für die Immigration boviner intM in das Gewebe einnehmen können.

 

Nach ihrer Einwanderung ins Gewebe entwickeln sich Monozyten unter dem Einfluss von Gewebsmediatoren wie Chemokinen, Zytokinen oder mikrobiellen Bestandteilen zu funktionell unterschiedlichen Makrophagensubtypen. In diesem Zusammenhang wurde die Hypothese geprüft, dass die Anwesenheit von CCL5 oder PMN-DGP – bei­de mit Aktivierungspotenzial für cM und intM ‒ die In-vitro-Differenzierung dieser Subpopulationen zu bestimmten Makrophagensubtypen steuern können. Die Anwesenheit des Chemokins CCL5 steuerte die In-vitro-Differenzierung boviner CD14-positiver Monozyten zu einem Makrophagenphänotyp, der mit einer reduzierten Expression von sowohl M1- als auch M2-relevanten Genen auf eine Stimulation mit LPS reagierte. Dies spricht gegen einen polarisierenden Effekt von CCL5 und deutet eher auf die Induktion eines funktionell toleranten Phänotyps der CCL5-differenzierten Makrophagen.

Auch für die unter PMN-DGP-Einfluss differenzierten Makrophagen, die einen M2-ähnlichen Phänotyp zeigten, spricht die verstärkte Produktion von M1- und M2- Zytokinen gegen eine polarisierende Wirkung von PMN-DGP und eher für mixed-phenotype-Makrophagen. Die Entwicklung solcher Makrophagen könnte durch die kombinierte Wirkung verschiedener Granulainhaltsstoffe boviner PMN bewirkt worden sein. Vergleichbar mit dem humanen und murinen System erwiesen sich PMN-DGP-differenzierte bovine Makrophagen als Zellen mit einer gesteigerten anti-mikrobiellen Funktion, was sich an ihrer verstärkten Phagozytoseleistung und ROS-Produktion ablesen ließ.

 

Die Aufnahme von Glukose aus dem extrazellulären Raum spielt eine entscheidende Rolle für die Energiegewinnung bei aktivierten Monozyten. Im Gegensatz zu humanen Monozyten-Subpopulationen, die sich bezüglich ihrer Glucose-Aufnahmekapazität nicht unterscheiden, zeigten bovine cM und intM deutlich höhere Glukose-Aufnahmekapazitäten als ncM, was auf deren reduzierte GLUT3-Expression zurückgeführt werden könnte. Die insgesamt deutlich höhere Expression von GLUT3 im Vergleich zu GLUT1 deutet auf eine dominante Rolle dieses Transporters für die Glukose-Aufnahme durch bovine Monozyten. Interessanterweise ergab sich keine Beziehung zwischen dem Rückgang der Glukose-Aufnahmekapazität von Monozyten abgekalbt habender Milchkühe und der Entwicklung postpartaler Infektionserkrankungen (Mastitis, Metritis).

 

Die mögliche klinische Bedeutung von Monozyten-Subpopulationen ergab sich aus der Korrelation antepartaler Blutgehalte mit dem Auftreten postpartaler Infektionskrankheiten bei der laktierenden Milchkuh. So korrelierte eine erhöhte Anzahl von CD14-positiven Monozyten (cM und intM) im Blut der trächtigen Tiere mit dem Auftreten von Mastitiden und/oder Metritiden nach der Abkalbung. Erhöhte präpartale Zellzahlen von CD14-negativen Monozyten korrelierten hingegen negativ mit dem Auftreten dieser Erkrankungen im Postpartum.

 

 

Damit konnten in dieser Arbeit bovine klassische (CD14++CD16-), intermediäre (CD14++CD16++) und nichtklassische Monozyten (CD14+CD16++) identifiziert und ihre phänotypische als auch funktionelle Heterogenität charakterisiert werden. Während die Bedeutung von bovinen klassischen und intermediären Monozyten für anti-bakterielle Funktionen wie z. B. die Phagozytose und die ROS-Bildung deutlich herausgearbeitet werden konnte, bleibt die funktionelle Bedeutung der bovinen nicht-klassischen Monozyten noch weitgehend unklar. Während sich zumindest ein Chemokin (CCL5) und Degranulationsprodukte neutrophiler Granulozyten als chemo­taktisch für cM und/oder intM erweisen, ist über die Chemokine, die bovine ncM selektiv ansprechen, noch nichts bekannt. Gleichwohl konnten höhere antepartale ncM-Zahlen im Blut trächtiger Kühe als Biomarker für eine geringere Infektionsanfälligkeit identifiziert werden. Zusammen mit dem negativen prädiktiven Wert höherer cm/intM-Zahlen im Blut liegt hier womöglich ein Ansatz für die Entwicklung organ-spezifischer immunmodulatorischer Konzepte, welche die Förderung und/oder die Hemmung der Immigration bestimmter Zellen in das Gewebe zum Ziel haben.

keywords

Monozyt, Rind, Subpopulationen, monocyte, bovine, subsets

kb

1.277