HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Esther Humann-Ziehank

 

Labordiagnostische Untersuchungen zum Selenstoffwechsel von Schafen unter Berücksichtigung des ovinen Lungenadenokarzinoms

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2698

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2010

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_humann-ziehank.pdf

Zusammenfassung

Labordiagnostische Untersuchungsergebnisse können durch zahlreiche präanalytische Faktoren maßgeblich beeinflusst und verfälscht werden. Einleitend wurde daher eine Übersichtsarbeit zur labordiagnostischen Bedeutung der Präanalytik bei der Untersuchung von Blutproben sowie zu Möglichkeiten der Optimierung der Präanalytik erstellt. Die erarbeiteten Meilensteine bezüglich optimaler Probengewinnung, -aufbereitung und –lagerung boten das Fundament der folgenden experimentellen Arbeiten und wurden in die Qualitätssicherung eingebunden.

Die folgenden Arbeiten befassen sich mit dem Spurenelement Selen. Deutschland und viele Regionen Nordeuropas sind als Gebiete mit geringen Selengehalten der regional angebauten Futtermittel beschrieben worden. Selen ist ein essentieller, integraler Bestandteil der Selenoenzyme und –proteine, nur einige davon konnten bisher auch funktionell charakterisiert werden. So nehmen die Glutathionperoxidasen (GPx) und Thioredoxin Reduktasen (TRxR) vor allem antioxidative Funktionen wahr, die Iodothyronindeiodinase1 (Dio1) ist ein wichtiges Enzym im Schilddrüsenhormonmetabolismus. Die Glutathion-S-Transferase alpha (aGST) ist kein Selenoenzym, wird aber im Selenmangel möglicherweise bei sinkender zellulärer, antioxidativer Kapazität als Kompensationseffekt vermehrt exprimiert. Neben Studien zu den funktionellen Grundlagen findet Selen aufgrund seiner Rolle im antioxidativen Stoffwechsel zunehmend auch Beachtung in der Forschung zur Krebsprävention.

Zunächst wurde in dieser Arbeit die Ausprägung der Selenunterversorgung in deutschen Schafherden epidemiologisch und anhand von Bestandsmerkmalen untersucht. Über ein Drittel aller untersuchten Schafherden (n=150) wiesen im Serum einen deutlich zu geringen Selenstatus auf, der eine Optimierung des Fütterungsregimes dringend erfordert. Dabei zeigte sich, dass die Angabe des Landwirts, Mineralfutter einzusetzen, keinerlei Sicherheit für eine Annahme einer ausreichenden Versorgung der Tiere darstellt. Eine Überprüfung der Selenkonzentrationen im Serum ist daher im Rahmen der Herdenbetreuung ratsam. Einflussfaktoren für eine Selenunterversorgung waren vor allem die Herdengröße sowie die Haltung als Wanderschafherde während der Weideperiode.

Des Weiteren wurde im experimentellen Ansatz die, durch das Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV) induzierte, ovine Lungenadenomatose (ovine pulmonary adenocarcinoma (OPA)) mit zwei verschiedenen Selenversorgungsstufen kombiniert und damit ein neues Studienmodell etabliert. Ziel war die Untersuchung des möglichen Zusammenhangs zwischen Selenstatus und Tumorprogression im Langzeitmodell.

Als methodische Grundlage für diese Fragestellung wurde zunächst die Computertomographie (CT) der Schaflunge unter standardisierten Bedingungen eingeführt und ein CT-OPA-Score System zur Quantifizierung der Lungenveränderungen bei wiederholten Untersuchungen erarbeitet. Die CT-Befunde und daraus generierten CT-OPA-Scores korrelierten gut mit den pathomorphologischen und –histologischen Untersuchungsergebnissen. Vorteile gegenüber der Röntgentechnik sind die frühe und sensitive Darstellung sowie die klare Lokalisierung und Wiederfindung bereits kleiner Lungenveränderungen bei Schafen mit OPA.

Für die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Selenstatus und Tumorprogression wurden sechzehn adulte, natürlich im Herkunftsbetrieb mit JSRV infizierte Versuchstiere in zwei Gruppen unterteilt und mit marginaler (<0,05 mg Se/kg Trockensubstanz (TS)) beziehungsweise bedarfsgerechter (0,2 mg Se/kg TS) Selenkonzentration in der Gesamtration gefüttert. Die JSRV-Infektion wurde in der bronchoalveolären Lavage, sowie später postmortal in Lunge und Lungenlympfknoten mittels PCR belegt. Die OPA­-Progression wurde über einen Zeitraum von zwei Jahren mittels Lungen-CT dargestellt. Pathomorphologische, pathohistologische sowie immunhistologische Untersuchungen schlossen diese erste Nutzung von OPA als Tumormodell mit nutritiv modulierten Bedingungen ab. Das Fütterungsregime führte zu signifikanten Gruppenunterschieden in den Selenkonzentrationen und den zytosolischen GPx1-Aktivitäten im Lungengewebe. Die immunhistochemische Intensität der GPx1-Markierung erschien reziprok zur Tumorgröße. Die vierteljährliche Untersuchung der Lungen mittels CT ergab über einen Zeitraum von zwei Jahren keine Unterschiede in der Tumorprogression zwischen den beiden Fütterungsgruppen. Jedoch erwies sich das Tumormodell als geeignet für Langzeituntersuchungen unter Einbeziehung nutritiv modulierbarer Einflussfaktoren.

Die weiteren Auswirkungen der differenzierten Selenfütterung auf labordiagnostische Parameter wurden über Blutuntersuchungen, durch vierteljährlich gewonnene Leberbioptate sowie postmortal untersucht. Während der gesamten Untersuchungsphase wurden keine klinischen Anzeichen einer Nutritiven Muskeldystrophie bei den Versuchstieren festgestellt. Die Untersuchung der hämatologischen und klinisch-chemischen Routineparameter einschließlich leber- und muskelspezifischer Enzyme ergab ebenfalls in beiden Gruppen keine besonderen Auffälligkeiten. Leber, Nieren, Herzmuskel und Schilddrüse dagegen zeigten signifikante Gruppenunterschiede in den Selenkonzentrationen (nicht Niere) sowie in den zytosolischen GPx1-Aktivitäten. Für die zellulären TrxR- und Dio1-Aktivitäten ließ sich dieser Effekt nur im Lebergewebe nachweisen. Im Blut erwies sich die Serum-Selenkonzentration als sensitiver Marker der nutritiven Selenversorgung. Zudem reflektierte die Leber-Selenkonzentration die Futterumstellung auf die bedarfsgerechte Selensubstitution innerhalb weniger Tage. Die hepatische GPx1-Aktivität erreichte ein Maximum erst zwischen Tag 100-200 und fiel danach wieder ab. Die marginal mit Selen versorgten Schafe zeigten einen kontinuierlichen Abfall der Selenkonzentration im Serum auf 50% des Ausgangsniveaus innerhalb von zwei Jahren, wohingegen die Leber-Selenkonzentrationen dieser Gruppe unverändert blieben. Die GPx-Aktivität im Vollblut stieg nach Umstellung auf die bedarfsgerechte Selenzufuhr nur langsam in einen Zeitraum von etwa drei Monaten, parallel zur Regeneration des Erythrozytenpools, an. Die höhere relative, hepatische GPx1 mRNA Expression der bedarfsgerecht gefütterten Gruppe korrespondierte mit der hohen hepatischen GPx1-Aktivität. Die vermehrte Expression der hepatischen aGST mRNA bei den marginal mit Selen versorgten Schafen verdeutlichte die metabolische Relevanz der Unterversorgung mit Selen, da dieses Enzym vermutlich als Kompensation der verminderten anitoxidativen Kapazität der Zelle vermehrt exprimiert wird. Die Daten der metabolischen Untersuchungen zeigen zusammenfassend, dass die Selenkonzentrationen in Serum und Leber sowie die hepatische GPx1-Aktivität innerhalb weniger Tage die gesteigerte Selensupplementierung reflektierten, wohingegen die Vollblut-GPx-Aktivität nur sehr langsam anstieg, was die diagnostische Nutzbarkeit dieses Parameters bei wechselnder Fütterung einschränkt. Zentrale Stoffwechselorgane sind von einer marginalen, nutritiven Selenzufuhr bereits in der subklinischen Phase über eine deutliche Beeinträchtigung des zellulären, antioxidativen Systems betroffen.

 

summary

A multitude of animal-related and technique-related factors in the pre-analytical period affect the diagnostic outcomes of the laboratory approach. The aim of the review was to highlight the importance and source of pre-analytical factors with special respect to diagnostics of farm animals. The knowledge of these factors is a basic requirement for controlling their impact. Therefore, this opening paragraph represents the basic requirements for the experimental studies covered below.

 

Germany, as well as other countries in northern Europe, was previously considered to provide low selenium in regional grown fodder. Adequate nutritional supplementation of the essential trace element selenium is indispensable for adequate selenoprotein expression and function in animal and human health. The selenoenzymes glutathione peroxidase (GPx) and thioredoxin reductase (TrxR) have main functions in the antioxidative system. The iodothyronine deiodinase1 (Dio1) balances the local and systemic concentrations of active and inactive forms of thyroid hormones. Nutritional selenium deficiency was found to up-regulate the expression of phase II enzymes such as cytosolic glutathione-S-transferase alpha (aGST). Additionally, the specific impact of selenium in carcinogenesis has been discussed intensively in the scientific community during the last years due to the potential of supplements and functional food approaches in cancer prevention and therapy.

 

One aim of the presented investigations was to determine the occurrence of selenium deficiency in an epidemiological study including 150 German sheep flocks. Obviously, selenium deficiency is widespread in German sheep flocks. More than one third of the flocks showed relevant selenium deficiency in serum indicating the strong need to optimise the nutritional management. Using mineral supplements in general was no key factor for different selenium status. As it is impossible for the veterinarian to estimate the final forage Se concentration by environmental factors only, there is a need for validation at animal level. Factors raising suspicion of selenium imbalances are large flocks and transhumance. Stationary flocks had constantly higher mean serum selenium concentrations during the breeding, lambing and grazing period, whereas flocks practising transhumance had significant lower Se status except during lambing.

 

In the scientific context of the postulated impact of selenium in cancer, we introduced an innovative animal model on lung carcinogenesis using the Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV) induced ovine pulmonary adenocarcinoma (OPA). A score-based quantification of OPA visualised by computed tomography (CT) of the lung was developed. This provides a scientific tool to characterise OPA progression over time in consecutive examinations. Postmortem findings and histopathology of the lung showed good correlation with data from CT. The obvious advantage of the CT technique in contrast to established x-ray imaging was the early and sensitive detection as well as clear localisation of even slight lung alterations in JSRV infected sheep.

Thereafter, we examined the outcome of adequate (0.2 mg Se/kg dry weight (dw)) vs. marginal (<0.05mg Se/kg dw) nutritional selenium supplementation on OPA progression over a two-year period in 16 adult JSRV infected sheep. This represents the first outcome of using OPA as an experimental, long-term large animal cancer model combined with nutritional modifications. Pro-viral JSRV-DNA was evident in bronchoalveolar lavage cells, lung tissue and lung lymph nodes of the sheep. Adequate vs. marginal nutritional selenium supplementation caused significant differences in selenium concentration and cytosolic GPx1 activity in lung tissues of the two groups. Immunohistochemistry suggested a coherency of GPx1 immunolabelling depending on the tumour size which may depend on proliferation rate. Proliferation of OPA over time was monitored precisely by CT technique; a coherency of cancer progression with nutritional selenium supplementation was not evident. The model proved to be suitable for long-term studies of lung cancer proliferation including the impact of modifiable nutritional factors.

Additionally, the metabolic consequences of the upgrade from marginal to adequate nutritional selenium supplementation were followed biweekly by analysing selenium concentration, GPx activity (GPx1/GPx3) and routine biochemistry in blood/serum. Selenium, copper, zinc, GPx1 and TrxR activity were measured in liver (biopsies/post-mortem). Selenium, GPx1, TrxR, aGST and Dio1 were analysed in the kidney, heart muscle and the thyroid. Relative mRNA expression of hepatic aGST and GPx1 were determined.

Improvement of selenium supplementation strongly altered serum and liver selenium concentration within 10 and 20 days, respectively, followed by a plateau. Whereas the achievement of a maximum whole blood GPx activity was reached after three months, serum GPx3 activity increased with high variations. Hepatic GPx1 activity reached a maximum around day 100-200 while decreasing thereafter. Distinct group differences in selenium concentration and cytosolic GPx1 activity were evident in all organs (except selenium in the kidney). TrxR and Dio1 activity were affected only in the liver. The controls showed a persistent selenium deprivation reducing concentrations of serum selenium by 50% within two years, whereas liver selenium remained almost unaffected. Relative aGST mRNA expression was higher in selenium-deficient sheep. The higher relative mRNA expression of GPx1 in the adequately supplemented group reflected the high hepatic GPx1 activity. Taking the metabolic data together, selenium concentration in serum/liver and hepatic GPx1 activity reliably reflected the upgrade of selenium supplementation within days. Whole blood GPx reacts slowly depending on newly formed erythrocytes restricting its diagnostic use. Marginally selenium supplemented sheep underwent ongoing selenium deprivation. Vital organs are affected by selenium deficiency attenuating functional parts of the antioxidative system. Severity of the selenium deficient stage was proved by cellular up-regulation of aGST mRNA expression counteracting the restricted antioxidant defence.

keywords

Selen, Labordiagnostik, Ovines Lungenadenokarzinom, selenium, laboratory diagnostics, ovine pulmonary adenocarcinoma

kb

387