HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Isabel Hennig-Pauka

 

Respiratory disease markers in porcine bronchoalveolar lavage fluid

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2375

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2007

text

/dissertations/h_hennig-pauka07.pdf

Zusammenfassung

Marker für Respirationserkrankungen in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit desSchweines

Die bronchoalveoläre Lavage (BAL) beim Schwein wird sowohl für die Diagnosestellung in der tierärztlichen Praxis als auch im Rahmen experimenteller Untersuchungen eingesetzt. In dieser Studie wurde bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) auf Markersubstanzen für

die Diagnostik von Erkrankungen des Respirationstraktes beim Schwein untersucht. BALF von nicht infizierten Schweinen wurde mit BALF von experimentell mit Actinobacillus pleuropneumoniae

(A.pp.) infizierten Schweinen verglichen. Infektionen des Respirationstraktes führen zum Einwandern von Entzündungszellen und verändern die Zusammensetzung des die Atemwege benetzenden Flüssigkeitsfilms. Das antibakterielle Peptid PR-39, das eine hohe Korrelation mit dem prozentualen Anteil der neutrophilen Granulozyten (PMN) in der BALF aufwies, konnte als möglicher neuer Krankheitsmarker identifiziert werden. Zunächst wurden verschiedene praktikable BAL Methoden beim Schwein miteinander verglichen.

Gleichzeitig wurde die Aussagekraft von PR-39 und dem prozentualen Anteil der PMNs bei verschiedenen, natürlich auftretenden Respirationserkrankungen unter Praxisbedingungen untersucht.

Untersuchung des Respirationstraktes während der experimentellen A.-pp.-Infektion

Für die Untersuchung von Veränderungen in der BALF-Zusammensetzung nach experimenteller Infektion erwies sich die bronchoskopische BAL nach einem standardisierten Protokoll als geeignete Methode. Die Bedeutung der lavagierten Lungenlokalisation und die Zusammensetzung der zurückgewonnenen Flüssigkeitsfraktionen wurden untersucht. Der Einfluß der BAL selbst auf die Zusammensetzung der BALF gesunder Schweine war zu

vernachlässigen. Für gesunde Schweine der Altersgruppe, die in den Infektionsexperimenten verwendet wurden, wurden Referenzgrenzen für bestimmte Parameter in bronchoskopischer BALF erstellt. Für die Beurteilung von Entzündungsanzeichen in den Atemwegen wurde ein

bronchoskopisches Bewertungssystem etabliert. Es ergab sich jedoch kein statistischer Zusammenhang zwischen den bronchoskopisch erhobenen Befunden und den tatsächlich vorliegenden pathologischen Lungenveränderungen.

Verschiedene Infektionsrouten für die experimentelle A.-pp.-Infektion wurden beschrieben und miteinander verglichen. Die Aerosolinfektion mit A.pp. ähnelte im Verlauf am ehesten einer natürlichen Infektion und wurde für Läuferschweine bevorzugt eingesetzt. In ausgewachsenen Schweinen konnten schwere Krankheitsverläufe durch die intratracheale Applikation der Infektionsdosis ohne Sichtkontrolle ausgelöst werden.

Die Entstehung von Lungenveränderungen wurde während der experimentellen A.-pp.- Infektion mittels Lungenultraschall verfolgt. Pleuritische Veränderungen und Lungengewebssequester konnten mit einer Sensitivität von 87,5% und einer Spezifität von 71% an Tag 4

nach der Infektion, und mit einer Sensitivität von 50% und einer Spezifität von 85,7% an Tag 21 nach der Infektion diagnostiziert werden. Das Ausmaß der pathomorphologischen Lungenveränderungen konnte mittels Lungenultraschall nicht bestimmt werden.

Krankheitsmarker in BALF

Um der Komplexität der BALF-Zusammensetzung Rechnung zu tragen, wurden verschiedene Analysemethoden angewendet, bei denen BALF von lungenkranken Schweinen mit BALF von lungengesunden Schweinen verglichen wurde.

In einem ersten Ansatz wurde die BALF in ihre einzelnen und bisher überwiegend unbekannten Bestandteile aufgetrennt. In einem zweiten Ansatz wurden spezifische BALFKomponenten direkt untersucht. Weder durch Surfaktantuntersuchungen, noch durch die Analyse von BALF-Proteinen mittels Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI) Massenspektrometrie, noch durch Phage Display konnten Krankheitsmarker für einen möglichen Einsatz in der veterinärmedizinischen Praxis identifiziert werden.

Bei der Untersuchung der BALF-Proteinzusammensetzung mit Hilfe der 2D-Gelelektrophorese wurden zwölf Proteine vermehrt in der BALF von chronisch infizierten Schweinen nachgewiesen und mit Quadrupole Time of Flight Massenspektrometrie weiter untersucht.

Drei dieser Proteine wurden als die antibakteriellen Peptide Prophenin-2 und PR-39 sowie das Kalzium bindende Protein Calgranulin C identifiziert. Zusätzlich zum prozentualen Anteil der PMNs erwies sich PR-39 als ein vielversprechender Krankheitsmarker. Mittels eines PR-

39-Capture-ELISA wurde BALF von 36 experimentell infizierten Schweinen untersucht. In chronisch infizierten Schweinen ergaben sich bei einem Cut-off von 1 nM PR-39 eine Sensitivität von 90% und eine Spezifität von 68%. Als diagnostischer Marker war PR-39 im

chronischen Krankheitsstadium der experimentellen A.-pp.-Infektion dem prozentualen Anteil der PMNs überlegen. Eine antibakterielle Wirkung von PR-39 gegenüber A.pp. konnte in vitro nur mit äußerst hohen PR-39-Konzentrationen hervorgerufen werden.

Bewertung von PR-39 als Marker für Erkrankungen des Respirationstraktes

Um den Einfluß verschiedener BAL-Methoden auf Messgrößen in der BALF zu untersuchen, wurden die drei in der Praxis am häufigsten angewandten Methoden - die bronchoskopische BAL mit Sichtkontrolle und die endotracheale und transtracheale BAL ohne Sichtkontrolle -

an gesunden Schweinen miteinander verglichen. Die Differenzierung von Zellen war in endotrachealer BALF kaum möglich, während PR-39 in BALF, die mit allen drei Methoden gewonnen worden war, nachgewiesen werden konnte. Die auffälligsten methodisch

bedingten Unterschiede in der BALF-Zusammensetzung war die niedrigere Nachweisrate von Plattenepithelzellen aus der Maul- und Rachenschleimhaut und die damit verbundene Zusammenfassung

niedrige Nachweisrate von Schleimhautkommensalen und Umweltkeimen in transtrachealer BALF. Die höchste diagnostische Empfindlichkeit für den Nachweis von M. hyopneumoniae mittels PCR ergab sich mit bronchoskopischer BALF. Für Messgrößen in endotrachealer und transtrachealer BALF konnten vorläufige Referenzbereiche erstellt werden.

PR-39 als ein diagnostischer Marker, der unabhängig von der Erkrankungsursache bestimmt werden kann, wurde unter Praxisbedingungen in bronchoskopischer, endotrachealer oder transtrachealer BALF von Schweinen aus elf Beständen untersucht. Das Hauptaugenmerk der Untersuchung lag dabei auf den mikrobiologischen und zytologischen Befunden sowie auf den PR-39-Konzentrationen. In einem Bestand mit einem guten klinischen respiratorischen Gesundheitsstatus (HH) wiesen 43% der Tiere, und in Beständen mit niedrigem klinischen respiratorischen Gesundheitsstatus oder in Tieren mit bronchoskopisch sichtbaren pathologischen Veränderungen der oberen Atemwege (LH) wiesen 76% der Tiere fakultativ pathogene Erreger in der BALF auf. Somit ist ein positiver Erregernachweis nicht auch zwangsläufig gleichbedeutend mit einer Erkrankung des Respirationstraktes. In LH Tieren konnte eine hohe Korrelation zwischen dem prozentualen Anteil der PMNs und der PR-39 Konzentration nachgewiesen werden. Auf diesen Befunden aufbauend wurde eine neue Definition für eine Erkrankung des Respirationstraktes erstellt, die besagt, dass nur solche Tiere als krank eingestuft werden, die einen positiven Erregernachweis in Kombination mit mehr als 9% PMNs in bronchoskopischer bzw. mehr als 40% PMNs in transtrachealer BALF aufweisen. Unabhängig von der BAL-Methode zeigte sich eine gute Korrelation von PR-39 zu dieser Krankheitsdefinition. In bronchoskopischer BALF wiesen 89% der erkrankten Tiere PR-39-Konzentrationen über 2,5 nM, und in transtrachealer BALF wiesen 90% der erkrankten Tiere über 5 nM auf. Schweine mit höheren PR-39-Konzentrationen hatten ein statistisch signifikantes, 72fach höheres Risiko, erkrankt zu sein. Eine Bewertung des klinischen respiratorischen Herdengesundheitsstatus erscheint daher mit Hilfe der PR-39- Konzentrationsbestimmung in BALF möglich, wenn die unterschiedlichen BAL-Methodenabhängigen Cut-offs (2,5 nM in bronchoskopischer BALF und 5 nM in transtrachealer BALF)

berücksichtigt werden. Da auch in einem klinisch gesunden Nukleusbestand Tiere mit PR- 39-Konzentrationen in BALF gefunden wurden, die die o.g. Cut-offs überschreiten, sollten nur solche Bestände als krank eingestuft werden, in denen mehr als 25% der Tiere einer

zufällig entnommenen repräsentativen Stichprobe höhere PR-39-Konzentrationen haben als 2,5 nM in bronchoskopischer bzw. 5 nM in transtrachealer BALF. Als azellulärer BALFBestandteil ist PR-39 ein einfach verfügbarer Krankheitsmarker, mit dem sowohl Einzeltiere

als auch Bestände auf das Vorliegen einer subklinischen, durch bakterielle Erreger verursachten, Entzündung untersucht werden können. Dieser Marker lässt sich unabhängig von der Ursache für die Erkrankung nutzen und ist außerdem dafür geeignet, BALF-Proben für

die weiterführende mikrobiologische Diagnostik auszuwählen.

 

keywords

Actinobacillus pleuropneumoniae, Schwein, Krankheitsmarker, pig, disease marker

kb

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