HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Florian Geburek

 

Intraläsionale Therapie mit autologen mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und

Blutprodukten sowie Verlaufskontrollen bei Pferden mit Sehnenerkrankungen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2860

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_geburek18.pdf

Zusammenfassung

 Sehnenerkrankungen der oberflächlichen Beugesehne kommen bei Pferden häufig vor und sind zumeist degenerativer Natur. Aufgrund der langsamen Sehnenheilung und der hohen Rezidivrate besteht ein hohes Interesse daran, die Heilung zu beschleunigen und die Qualität des Ersatzgewebes zu verbessern. Zahlreiche bisher angewendete Verfahren wie die intratendinöse Applikation einer Vielzahl von Therapeutika und chirurgische Ansätze liefern ein unbefriedigendes Ergebnis. Kontrollierte Bewegung mit sukzessive gesteigerten Intervallen gilt als etablierte und effektive Therapieform. Seit ca. 15 Jahren sind bei der Sehnenbehandlung im Pferdebereich potentiell regenerative Therapieverfahren, die auf der Applikation von zumeist autologen Blutprodukten (z.B. thrombozytenreichem Plasma, PRP) und zellreichen Substraten (z.B. mesenchymalen Stromazellen, MSCs) aus Knochenmark und Fettgewebe basieren, in den Fokus der Forschung und klinischen Anwendung gerückt. Ziel der vorliegenden Habilitationsarbeit war es, verschiedene aktuelle Therapieansätze aus dem Formenkreis der regenerativen Medizin in Bezug auf ihre Bedeutung bei der intraläsionalen Therapie equiner Sehnenerkrankungen näher zu untersuchen. Dabei wurden insbesondere Substrate und Anwendungen berücksichtigt, zu denen während der Konzeption der Untersuchungen keine oder wenige Daten in der Literatur verfügbar waren. Die Ziele der vorliegenden Arbeit gliedern sich in drei Bereiche: 1.) Zunächst sollte untersucht werden, wie sich die Knochenmarkentnahme und die Ausbeute an MSCs aus Knochenmark aus dem equinen Brustbein optimieren lässt und welche Bedeutung die kurzfristige Lagerung von autologen Thrombozytenkonzentraten im Hinblick auf ihren Zell- und Wachstumsfaktorengehalt besitzt. 2.) Das zweite Ziel der Arbeit war die Charakterisierung des diagnostischen Wertes

etablierter und neuer Methoden bei der Verlaufskontrolle von Erkrankungen der oberflächlichen Beugesehne. Dazu wurden die klinische Untersuchung und die B-mode- sowie die Farb-Doppler-Sonographie, die Utrasonographische Gewebecharakterisierung (UTC), die Feinnadelbiopsie, die histologische Untersuchung sowie mehrere Methoden zur Nachverfolgung des Verbleibs von markierten MSCs („cell tracking“) angewendet (Niederfeld Magnetresonanztomographie am stehenden Pferd, postmortale Licht- und Fluoreszenzmikroskopie, Immunfluoreszenz) 3.) Den dritten Aspekt und Schwerpunkt der Arbeit bildeten zwei tierexperimentelle Untersuchungen und zwei kontrollierte Untersuchungen an Pferden mit natürlichen Sehnenschäden. Dazu wurden die Effekte autologer MSCs aus Fettgewebe (adipose tissue, AT) auf chirurgisch erzeugte Läsionen der oberflächlichen Beugesehne überprüft. Dabei kamen die Utrasonographische Gewebecharakterisierung (UTC) und Farb-Doppler-Sonographie sowie finale histologische, biochemische und biomechanische Untersuchungen zum Einsatz. Zudem wurden die Effekte von autologem konditioniertem Serum und eines autologen thromobozytenreichen Plasmaproduktes auf natürlich entstandene Läsionen der oberflächlichen Beugesehne überprüft. Besondere Aspekte waren die feingewebliche Verlaufskontrolle durch Gewinnung sequentieller Feinnadelbioptate bzw. der Einsatz der UTC-Technik, um die Sehnenheilung im zeitlichen Verlauf zu überwachen. Die an Brustbeinen vorgenommenen Untersuchungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass das Sternum bei Warmblutpferden einheitlich aus 7 Segmenten besteht und das Volumen der Sternebrae mit dem Alter der Pferde zunimmt. Die 4. und 5. Sternebra erscheinen aufgrund ihrer Kugelform, ihres hohen Volumens, der wenig prominenten Crista sterni am ventralen Aspekt dieses Brustbeinabschnittes und der guten Zugänglichkeit am stehenden Pferd am besten für die Punktion geeignet. Die Ultrasonographie ermöglichte eine gute Abschätzung der Dicke des Weichgewebes, die das kaudale Brustbein überlagert, und die Festlegung geeigneter Punktionsstellen. Die gewünschte Eindringtiefe der Knochenmarkpunktionskanüle in das Sternum kann durch Messungen am 5. besser als am 4. Brustbeinsegment vorherbestimmt werden. Die Untersuchung zeigte, dass bei beiden Sternebrae eine geringe Penetrationstiefe des Brustbeines von ca. 10 mm zur MSC-Gewinnung ausreichend ist, wenngleich eine Tiefe von ca. 30 mm bei gleicher Sicherheit zuverlässiger ausreichende Knochenmarksvolumina liefert. Zusammenfassend zeigte sich, dass die 5. Sternebra am besten für die Gewinnung von Knochenmark zur MSC Aufbereitung geeignet ist. Die Kultur und Expansion von MSCs war bei Nutzung von fetalem Kälberserum im Vergleich zu standardisiertem Pferdserum und autologem Serum am effektivsten. Im Rahmen der Untersuchung zweier in praxi gebräuchlicher Thrombozytenkonzentrate zeigte sich, dass die Zubereitungen ad modum E-PET (Equine Platelet Enhancement Therapy) und ACP® (Autologous Conditioned Plasma) bei Raumtemperatur mindestens 6 Stunden lang aufbewahrt werden können, ohne dass es zu einem Abfall des Wachstumsfaktorengehaltes kommt. Der Wachstumsfaktorengehalt von Thrombozytenkonzentraten weist je nach Herstellungsverfahren deutliche Unterschiede auf. Ein einheitliches Muster von Abhängigkeiten zwischen den Komponenten der Konzentrate und den gemessenen Wachstumsfaktorenkonzentrationen lässt sich vor dem Hintergrund der eigenen Untersuchung nicht darstellen. Die klinische Untersuchung hatte zu Beginn der Sehnenerkrankung einen hohen diagnostischen Wert und bleibt ein einfach anwendbarer grundlegender Bestandteil der Untersuchung von Pferden mit Tendopathien. Mittels B-mode Sonographie war die tatsächliche Analyse der Sehnenintegrität nur eingeschränkt und indirekt möglich. Etablierte Scores stellten den Untersucher vor Entscheidungsschwierigkeiten. Querschnittsmessungen lieferten ein präziseres Ergebnis, wenn die zu umfahrende Struktur klar demarkiert war. Das Verfahren ermöglicht die Einordnung der eigenen Untersuchungsergebnisse in die Literaturangaben. Die B-mode Ultrasonographie erwies sich zur Nachverfolgung dezent ausgeprägter chirurgisch erzeugter Läsionen als wenig geeignet. Der diagnostische Wert der UTC Untersuchung war im Rahmen von Verlaufsuntersuchungen aufgrund der guten Reproduzierbarkeit und der Unterscheidbarkeit verschiedener Gewebetypen auch bei gering ausgeprägten Sehnenschäden hoch. Im Vergleich zu vorangegangenen Studien konnte bei der Doppler-sonographischen Untersuchung der Sehnen die Intensität des Doppler-Signales durch die Weiterentwicklung des Untersuchungsverfahrens stärker objektiviert und noch präziser erfasst werden. Die Untersuchungstechnik war gut für die nicht-invasive Einschätzung der Perfusion von Tendopathien geeignet. Die Ergebnisse können mit der feingeweblich nachweisbaren Anzahl von Blutgefäßen abgeglichen werden. Es handelt sich um die erste Studie, in der die wiederholte Feinnadel-Sehnenbiopsie zur Verlaufskontrolle der Sehnenheilung über einen Zeitraum von 24 Wochen bei Pferden angewendet wurde. Die Feinnadel-Sehnenbiopsie stellt ein wertvolles Diagnostikum dar, da sie grundsätzlich eine direkte Beurteilung der feingeweblichen Sehnenstrukur und sogar eine Quantifizierung der immunhistochemisch dargestellten Expression der Kollagentypen I und III erlaubt, die in der vorliegenden Arbeit computergestützt mittels Densiometrie vorgenommen wurde. Nach einer einmaligen intraläsionalen Behandlung chirurgisch erzeugter Sehnenläsionen mit 10 x 106 autologen AT-MSCs lieferten alle angewendeten Untersuchungsverfahren übereinstimmend Hinweise auf die Präsenz einer hohen Anzahl dieser Zellen im Bereich der Läsionen in einem Zeitraum von bis zu 9 Wochen nach der Applikation. Die frühe Integration („homing“, „engraftment“) der injizierten AT-MSCs in die heilende Sehnenläsion ist wahrscheinlich ein entscheidender Mechanismus dieser Therapieform. In vivo Niederfeld MRT-Untersuchungen haben das Potential, als nicht-invasives Verfahren genutzt zu werden, um die Integration von AT-MSCs auch an Pferden mit natürlich entstandenen Tendopathien der oberflächlichen Beugesehne zu überprüfen. Eine einmalige intraläsionale Injektion von 10 x 106 kultivierten AT-MSCs, die in autologem inaktiviertem Serum suspendiert wurden, führte bei chirurgisch erzeugten OBS-Läsionen im Vergleich zu einer alleinigen Injektion von autologem inaktiviertem Serum in einem Beobachtungszeitraum von 22 Wochen

nicht zu einer Beschleunigung der Abheilung und nicht zu einer nachhaltigen Verbesserung der Qualität des Ersatzgewebes. Die AT-MSC-Behandlung hat möglicherweise einen positiven Einfluss auf die Quervernetzung („cross-linking“) von Kollagen und damit theoretisch auf die biomechanischen Eigenschaften von Narbengewebe, das sich noch in der Remodellierungsphase befindet, wenngleich die biomechanische Testung keine Unterschiede zwischen der Prüf- und Kontrollgruppe ergab. In der frühen Proliferationsphase der Sehnenheilung kam es nach AT-MSC-Behandlung zu einer erhöhten Perfusion (Doppler-Sonographie) und in der späten Proliferations- und frühen Remodellierungsphase zu einer erhöhten Neovaskularisation (Histologie) der chirurgisch erzeugten Sehnenläsionen. Eine verstärkte Durchblutung von Sehnen legt die Schlussfolgerung einer verbesserten Sehnenheilung in den frühen Phasen des Abheilungsprozesses nahe. Die mittels Doppler-Ultrasonographie festgestellte Perfusionsintensität der Sehne korrelierte am Ende des Untersuchungszeitraumes nicht mit der Anzahl der histologisch und immunhistochemisch (Faktor VIII) nachgewiesenen Gefäßanschnitte. Eine kontrollierte Untersuchung an Pferden mit natürlich entstandenen OBS-Läsionen lieferte Hinweise darauf, dass eine einmalige Injektion von autologem konditioniertem Serum zu einer frühen Lahmheitsreduktion und zur Verbesserung B-mode ultrasonographischer Parameter während der Proliferationsund frühen Remodellierungsphase beiträgt. Die Auswertung sequentieller Feinnadelbioptate zeigte, dass ACS möglicherweise zu einer reduzierten Proliferation von Tenozyten 5 Wochen nach Behandlung und zu einem Anstieg der Kollagentyp I Expression in der Remodellierungsphase führt, die Ausdruck einer gesteigerten Differenzierung von Sehnenzellen sein könnte. Die Ergebnisse einer randomisierten Placebo-kontrollierten Untersuchung zeigten, dass eine einmalige intraläsionale PRP-Behandlung von natürlich entstandenen Läsionen der OBS im Vergleich mit einer Placebo-Behandlung zu einer früheren Reduktion der Lahmheit führt. Die ultrasonographische Gewebecharkterisierung machte deutlich, dass Injektionen mit PRP im Zeitrahmen des Umbaues der fibrillären Sehnenmatrix zu Faszikeln zu einer verbesserten Organisation des Ersatzgewebes beiträgt, während die Remodellierung am Ende des Beobachtungszeitraumes noch nicht abgeschlossen war. Nach einer einmaligen PRP-Injektion erreichten innerhalb von 12 Monaten mehr Pferde ihr vorheriges Leistungsniveau als nach Placebo-Behandlung. Die Berücksichtigung der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit trägt dazu bei, Brustbeinpunktionen zu vereinfachen, ihre Komplikationsrisiken zu senken und eine hohe Ausbeute an MSCs aus Knochenmark zu erzielen. Weitere standardisierte Untersuchungen sind erforderlich, um eindeutige Einflussgrößen auf die zu erreichenden Konzentrationen der Wachstumsfaktoren in Thrombozytenkonzentraten zu bestimmen. Die Betrachtung des diagnostischen Wertes der angewendeten etablierten und neuen Methoden zur Verlaufskontrolle von equinen Sehnenerkrankungen zeigte, dass grundsätzlich eine multimodale Aufarbeitung sinnvoll ist, um einen schlüssigen Gesamteindruck vom Heilungsverlauf zu erhalten. Die Einbindung einfach anwendbarerer aber weniger sensitiver Verfahren ermöglicht es, einen Bezug zwischen wissenschaftlichen Untersuchungen und der klinischen Anwendung herzustellen. Der diagnostische Wert der UTC-Untersuchung war höher als der der B-mode Ultrasonographie. Eine häufigere Untersuchung im Rahmen von Verlaufskontrollen wäre demnach auch bei Pferden mit natürlichen Sehnenerkrankungen sinnvoll. Die erstmals im Rahmen einer kontrollierten Studie am chirurgischen Sehnenmodell untersuchte Wirkung einer einmaligen intraläsionalen Therapie mit AT-MSCs, bestand im Wesentlichen aus einer deutlichen Anregung der Sehnenperfusion und -vaskularisation. In Folgeuntersuchungen sollte überprüft werden, wie sich der Effekt bei Anwendung dieses Zelltyps an natürlich erkrankten Patienten und bei Änderungen der Zelldosis und des Behandlungsintervalles darstellt. Erstmals werden mit dieser Arbeit zwei kontrollierte Untersuchungen zum Effekt der Blutprodukte ACS und PRP auf natürlich entstandene Tendopathien vorgelegt. Beide Substrate zeigten schwache Effekte auf klinische und ultrasonographische Parameter. Bei zukünftigen Untersuchungen sollte überprüft werden, ob es durch frühere und häufigere Injektionen der untersuchten Blutprodukte zu einer Verstärkung der beobachteten Effekte kommt.

keywords

Regenerative Medizin, Bildgebung, PRP, ACS; regenerative  medicine, mesenchymal stromal cells, PRP, ACS, tendon, horse

kb

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