HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Marcus Fulde

 

Virulenzmechanismen zoonotischer Streptokokken

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2739

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_fulde15.pdf

Zusammenfassung

Nicht nur wegen der Transmission resistenter Bakterien stellen Zoonosen als vom Tier auf den Menschen übertragbare Erkrankungen einen zentralen Schwerpunkt in der modernen Infektionsforschung dar. Dabei sind die Ätiologien oft ganz unterschiedlich: während in industrialisierten Ländern der innige Kontakt zu Haustieren einen Ansteckungsschwerpunkt darstellt, ist in Entwicklungsländern häufig der enge Kontakt zu Nutztieren, der Verzehr unprozessierten Fleisches und/oder unzureichende Hygienemaßnahmen als ursächlich für eine zoonotische Infektion anzusehen. Diese Arbeiten beschäftigen sich hauptsächlich mit zwei Vertretern der Gattung Streptococcus (S.), die beispielhaft für die genannten Szenarien sind: S. canis, der vornehmlich bei domestizierten Karnivoren, wie Hund und Katze, vorkommt und S. suis, der als endemisch in der Schweinepopulation gilt.

Um zoonotische Infektionen durch Streptokokken effektiv bekämpfen zu können bzw. eine Transmission resistenter Isolate vom Tier auf den Menschen zu verhindern, ist ein profundes Wissen über die Virulenzmechanismen der Bakterien entscheidend. Die hier beschriebenen Arbeiten verfolgen zwei Strategien: im Kapitel „Metabolism meets Virulence“ wurde die Rolle des Arginin Deiminase Systems (ADS), eines primär metabolischen Systems in der Pathogenese von S. suis, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das ADS essentiell für das Überleben der Bakterien in einem sauren Milieu, wie zum Beispiel dem Phagolysosom, ist. Die Bakterien schützen sich durch Neutralisierung des pH-Wertes. Entscheidend dafür ist NH4+, das während der Katalyse von Arginin zu Ornithin und ATP gebildet wird. Für eine optimale Expression ist der ADS-spezifische Repressor ArgR, ein Vertreter der Familie der Arginin-abhängigen ArgR/AhrC Transkriptionsfaktoren, entscheidend. Ein Fehlen von ArgR resultiert in einer vollständigen Repression des ADS. Durch die resultierende Dysregulation des ADS übernimmt auch ArgR eine wichtige Funktion für das intrazelluläre Überleben von S. suis. Nicht nur das ADS allein, sondern auch dessen Substrat ist entscheidend für die biologische Fitness des Erregers. So führt eine Inaktivierung des ADS-assoziierten Arginin-Ornithin-Antiporters ArcD zu einer verringerten Aufnahme von Arginin und dadurch zu einer verringerten Produktion von NH4+. Auch in diesem Fall ist die Fähigkeit von S. suis intrazellulär zu überleben vermindert. Obwohl Arginin für Streptokokken eine essentielle Aminosäure darstellt, sind Stämme mit einer Defizienz im Arginin-Ornithin Antiporter ArcD Gen noch in der Lage, in einem chemisch definierten Medium zu wachsen. Es ist also davon auszugehen, dass das Genom von S. suis für weitere Proteine kodiert, die die Rekrutierung von Arginin ermöglichen. Im Gegensatz zu einer Arginin-abhängigen Induktion wird das ADS durch den primären Kohlenstoffdonor Glukose reprimiert. Dieser als Katabolitrepression verzeichnete Prozess wird in S. suis durch das Catabolite control protein A (CcpA) vermittelt. Eine Inaktivierung von CcpA führt (wenn auch indirekt) zum einen zu einer Dereperimierung des ADS. Auf der anderen Seite ist die Expression der Gene, die für die Kapselsynthese verantwortlich sind, massiv beeinträchtigt. Die Kapsel stellt jedoch den primären anti-phagozytischen Faktor von S. suis dar, so dass sich eine Deletion von CcpA als nachteilig für das bakterielle Überleben in der Gegenwart von Neutrophilen Granulozyten darstellt. Die Interaktion von S. canis mit dem Fibrinolysesystem des Wirtes stellt den zweiten Schwerpunkt dieser Habilitationsschrift dar und wird unter dem Titel „Plasminogen, eine Allzweckwaffe in der Pathogenese von Streptococcus spp.“ diskutiert. Die eigenen Daten zeigen, dass die Bakterien hochspezifisch mit Plasminogen interagieren. Verantwortlich dafür ist das S. canis M Protein (SCM), ein auf der bakteriellen Oberfläche verankertes Protein mit alpha-helikaler Struktur und der Tendenz zur Dimerisierung. SCM bindet an Plasminogen (PLG) via dem als miniplasminogen (mPLG) bezeichneten C-terminalen Teil des Zymogens, bestehend aus der Kringledomäne 5 und der proteolytischen Domäne und stellt damit den einzig bekannten bakteriellen Rezeptor für mPLG dar. Im Gegensatz zu anderen Vertretern der pyogenen Streptokokken, wie z.B. S. pyogenes oder humanpathogene S. dysgalactiae sub. equisimilis, verfügt S. canis nicht über eine intrinsische Plasminogenaktivierungskapazität und ist daher auf die wirtseigenen Plasminogenaktivatoren urokinase-type plasminogen activator (uPA) und tissue-type plasminogen activator (tPA) angewiesen. Durch Spaltung aktivieren diese PAs oberflächengebundenes Plasminogen und stellen den Bakterien somit proteolytisches Potential zur Verfügung. Damit sind die Bakterien in der Lage, semisynthetische Fibrinthromben zu degradieren, was einen potentiellen Virulenzmechanismus zur Dissemination im Wirt darstellt. Eine Immobilisation von PLG konnte, wenn auch signifikant schwächer, für SCM negative S. canis Isolate nachgewiesen werden. Als Rezeptor wurde die Enolase (ENO), ein zentrales Enzym der Glykolyse ermittelt. Auch die Phosphoglyzeratkinse (PGK) von S. pneumoniae konnte als Rezeptor für PLG bestätigt werden. Aufgrund übereinstimmender Aminosäuresequenzen ist davon auszugehen, dass auch die PGK von S. canis ein PLG-bindendes Potential aufweist. Primär metabolische Enzyme, die zusätzliche Funktionen, wie beispielsweise in der bakteriellen Pathogenese, aufweisen sind als moonlighting proteins bekannt. Im Gegensatz zu SCM binden sowohl ENO als auch PGK nicht über mPLG, sondern über den als Angiostatin bezeichneten N-terminalen Teil von PLG an das Zymogen. Nichtsdestotrotz ist das auf diese Weise gebundene Plasminogen aktivierbar und stellt somit eine weitere Möglichkeit dar, die bakterielle Oberfläche mit proteolytischer Aktivität zu dekorieren. SCM wird sezerniert und ist in der Lage, an die bakterielle Oberfläche zurückzubinden. Ob es sich dabei um einen aktiv proteolytischen Prozess handelt oder bedingt ist durch das Freiwerden von absterbenden Bakterien bleibt, offen. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Reassoziation von SCM entweder homophil durch an die Oberfläche fixiertes SCM erfolgt oder heterophil über PLG, das in diesem Fall als Brückenprotein zwischen den moonlighting proteins und SCM fungiert. Mit dieser Art der heterophilen Protein-Protein Interaktion konnte ein völlig neuer antiphagozytischer Mechanismus beschrieben werden, der auch eine Erklärung dafür liefern könnte, warum Isolate ohne antiphagozytische M Proteine invasive Infektionen im Wirt hervorrufen.

Zwar geht der translative Ansatz über die Fragestellung dieser Habilitationsschrift hinaus, ist es doch das Wissen über die Mechanismen zur Etablierung der bakteriellen Pathogenese, die es Wissenschaftlern erlaubt, aktiv Lösungsansätze zur Prävention zu entwickeln und somit einem der größten Probleme unserer Zeit, der steigenden Anzahl multi-resistenter Stämme, zu begegnen.

 

Summary

Not only because of the potential to transmit antibiotic resistant bacteria, infections caused by zoonotic pathogens display a main health hazard in modern infection medicine. Interestingly, the aetiologies vary significantly: while an intimate contact between pets and humans is the primary cause of transmission of zoonotic pathogens in industrialized countries, the close contact to lifestock, the consumption of unprocessed food and an insufficient hygiene regime are causative for zoonotic infections in the developing world. This work mainly deals with two members of the genus Streptococcus, which exemplary resemble both scenarios: while S. canis is mainly found in domestic carnivores such as dogs and cats, S. suis is endemic in the pig population.

To effectively combat zoonotic streptococcal infections and transmission of multiresistant bacteria from animals to humans, respectively, a profound knowledge about bacterial virulence mechanisms is required. The present work, thus, followed two strategies: the chapter “Metabolism meets Virulence” is focussed on the role of the Arginin Deiminase System (ADS), a primary metabolic system, in the pathogenesis of a S. suis infection. It was demonstrated that the ADS is essential for surviving acidic environments. This is mainly due to the generation of NH4+, a metabolite of ADS-mediated arginine catalysis. An optimal expression of the ADS relies on the local ADS-specific repressor protein ArgR, a member of the arginine-dependent ArgR/AhrC repressor family. Deleting argR completely abrogates ADS transcription, thus, characterizing ArgR, because of its ADS inducing role, as essential for S. suis to overcome acidic conditions. In addition to the ADS, also the substrate arginine is important for the biological fitness of S. suis. For example, deletion of the ADS-associated arginine-ornithine antiporter ArcD leads to a reduced uptake of arginine and, thus, to a lower amount of NH4+ in the bacterial growth medium. Consequently, arcD-negative strains are highly attenuated under acidic conditions in vitro and in vivo. Interestingly, although arginine displays an essential amino acid for the metabolism of streptococci, arcD-negative strains are still able to grow in a chemically defined medium, suggesting that additional arginine transport mechanisms exist which provides substrate for the ADS. In contrast to arginine, which induces ADS expression, supplementation of glucose significantly represses its transcription. This mechanism is termed Carbon Catabolite Repression and is mediated in S. suis and other Gram-positive bacteria via the Carbon control protein A (CcpA). Deleting the respective ccpA gene leads to a derepression of ADS transcription. In addition, the genes coding for the synthesis of the polysaccharide capsule apparatus were massively affected. Since the capsule represents the major antiphagocytic factor in S. suis, an isogenic strain defective in CcpA expression is significantly attenuated in phagocytosis assays using porcine PMNs.

The interaction of S. canis with the fibrinolytic system of the host represents the second key aspect of this habilitation treatise and is discussed in the chapter called „Plasminogen, eine Allzweckwaffe in der Pathogenese von Streptococcus spp”. It was demonstrated that bacteria specifically interact with plasminogen. This interaction is mediated by SCM, a surface-exposed alpha-helical protein with a high probability to form dimers. SCM binds to mPLG, the C-terminal part of the zymogen plasminogen consisting of kringle domain 5 and the proteolytic domain. Importantly, SCM represents the only bacterial receptor specifically recognizing mPLG. In contrast to other pyogenic streptococci, such as S. pyogenes and human pathogenic S. dysgalactiae sub. equisimilis, S. canis does not possess an intrinsic capability to activate plasminogen. Therefore, S. canis relies on the host-derived plasminogen activators urokinase-type plasminogen activator (uPA) or the tissue-type plasminogen activator (tPA). uPA and tPA, both, can activate surface-associated plasminogen by cleavage, thus, equipping S. canis with proteolyitc acitivity. Consequently, the pathogen is able to degrade semisynthetic fibrin thrombi, which represents a putative virulence trait for bacterial dissemination. Interestingly, a residual plasminogen binding capability was also detected for SCM-negative S. canis strains. The glycolytic enzyme enolase (ENO) was identified as the bacterial receptor. Furthermore, the phosphoglycerate kinase (PGK) of S. pneumoniae similary exhibits plasminogen-binding acitivity. Since the PGK of S. pneumoniae and S. canis exhbit a similar primary amino acid structure, a comparable affinity to plasminogen is assumed. Metabolic enzymes with a secondary, non-related functions, e.g. in bacterial pathogenesis, are well known as moonlighting proteins. In contrast to SCM which interacts with mPLG, the moonlighting proteins ENO and PGK bind to Angiostatin, reflecting the N-terminal part of the zymogen plasminogen. Since ENO-/PGK-bound plasminogen can similarly be activated by uPA and tPA, the decoration of the bacterial surface with proteolytic acitivty might likewise constitute a mechanism for bacterial spread in the host.

SCM is secreted but has also the ability to re-associate to the bacterial surface. However, whether this is an active, proteolytic process or simply relies on liberation by dying bacteria remains elusive. Nevertheless, re-association occurs either homophilically, via surface-bound SCM, or heterophilically via plasminogen. In the latter case, plasminogen functions as a bridging molecule between the moonlighting proteins and SCM. This mode of heterophilic protein-protein interaction reflects a new way of conferring antiphagocytic acitivity by M proteins and might explain why isolates lacking an antiphagocytic M protein now and then are able to induce systemic infections.

Although a translative approach by far exceeds the question of the present habilitation treatise, the knowledge about mechanisms needed for establishing bacterial pathogenesis allows scientists to actively develop solutions for prevention and, thus, might help to fight against one of the most challenging problems nowadays, the increasing amount of multi-resistant bacterial isolates.

 

keywords

Sreptococcus, Zoonose, Virulenzmechanismen,
Sreptococcus, zoonosis, virulence mechanisms

kb

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