HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Astrid Marlene Drotleff

 

Analytik funktioneller Inhaltsstoffe

(Tocotrienole und Eigelbproteine)

in Nebenprodukten der Lebensmittelverarbeitung

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2805

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_drotleff17.pdf

Zusammenfassung

Die Funktion eines Lebensmittelinhaltsstoffes ist immer mit dessen Molekülstruktur ver­knüpft. Übergeordnetes Ziel aller in dieser Habilitationsschrift zusammengefassten Studien war es, den Zusammenhang zwischen diesen Variablen wissenschaftlich zu beschreiben, indem der Einfluss technologischer Verfahren auf die Molekülstruktur und die Auswirkung auf technofunktionelle oder physiologische Eigenschaften bestimmt und miteinander korreliert worden sind. Diese Erkenntnisse könnten zukünftig wiederum gezielt zur Optimierung von Lebensmitteln oder pharmazeutisch wirksamen Produkten genutzt werden.

Das erste untersuchte Lebensmittel war Gerste, welche sich durch eine besondere Zusam­mensetzung ihres Vitamin E-Spektrums auszeichnet: Der Anteil der physiologisch und tech­nologisch interessanten Tocotrienole am Gesamt-Vitamin E (bestehend aus den acht Toco­chromanolen α-, β-, γ- und δ-Tocopherol und α-, β-, γ- und δ-Tocotrienol) ist mit ca. 70 % besonders hoch. Tocotrienole sind beispielsweise für ihre antikan­zerogene, cholesterin­biosynthesehemmende, sowie antioxidative Wirkung bekannt. Die potenziell beste euro­päische, aber bisher ungenutzte Quelle für Tocotrienole ist Trocken­treber, ein Gersten­nebenprodukt der Brauereiindustrie. Nach dem Brauprozess bleiben die Tocotrienole mit dem Treber zurück und liegen deswegen im Ver­gleich zur Braugerste ange­reichert vor. Die erste Herausforde­rung war, die Tocotrienole un­ter Erhalt der Molekülstruktur aus dem massenhaft zur Verfü­gung stehenden Rohstoff zu isolieren. Es konnte gezeigt werden, dass (1) die vom gemahle­nen Trockentreber abge­trennte Siebfraktion mit Partikelgrößen< 500 µm für die ethanolische Extraktion der Tocotrienole am besten geeignet war und (2) der Protein­gehalt in den Sieb­fraktionen positiv mit dem Tocochromanolgehalt korrelierte. Die nach Entfernen des Lösungsmittels vorliegen­den Öle hatten Tocotrienolgehalte von 516,8 bis 850,2 mg/kg, wie mit HPLC/Fluoreszenz (F)-Detektion be­stimmt wurde; das sind höhere Gehalte als im bekann­termaßen tocotrienolreichen Palmöl. Das neuentwickelte, schonende Verfahren ist voraus­sichtlich auch wirtschaftlich großtech­nisch umsetzbar.

Weiterhin wurde eine Humanstudie durchgeführt, bei der die Probanden eine orale Einmal­dosis von 450 mg Tocotrienolen aus α-tocotrienolreicher Gerste oder γ-tocotrienolreichem Palmöl einnahmen und im Zeitraum von 0-24 h nach der Applikation die Bioverfügbarkeit und die Pharmakokinetik der Tocotrienole untersucht wurde. Die Analyse der Tocochromanole im Blutplasma mithilfe der HPLC/F und der Metaboliten im Urin mittels HPLC/MS ergab, dass die Zusammensetzung des Tocotrienolspektrums in den Präparaten die Bioverfügbarkeit der einzelnen Tocochromanole beeinflusst. Eine wichtige Bedingung zur Erhöhung der Biover­fügbarkeit von Tocotrienolen ist, dass wenig oder kein α-Tocopherol gleichzeitig mit den Tocotrienolen aufgenommen wird. Die Auswertung der Daten ergab, dass die Absorption von Gesamttocotrienolen aus Gerstenöl signifikant höher war als die aus Palmöl, was auf die höhere Bioverfügbarkeit von α-Tocotrienol im Vergleich zum γ-Tocotrienol zurückzuführen war. Nachdem in der Humanstudie auch gezeigt werden konnte, dass eine Emulgierung des Palmölpräparats die Bioverfügbarkeit der Gesamttocotrienole erhöhte, wurde diese Bear­beitung auch bei Tocotrienolpräparaten aus Gerstenöl angewandt und die Wirkung der Emulgierung im Modell „Futter→Huhn→Ei“ getestet. Zum einen war der Transfer von Gerstenöltocotrienolen ins Ei höher als der von Palmöltocotrienolen und zum anderen be­wirkte die Emulgierung von Gerstenöltocotrienolen höhere Gehalte von Gesamttocotrienolen im Ei im Vergleich zum nicht emulgierten Präparat.

Wenn Tocotrienole ihre Funktion als Antioxidantien ausüben, werden sie selbst oxidiert, und es entsteht eine Reihe von Oxidationsprodukten. Mittels einer neu entwickelten Molekular­destillationsmethode konnten die wichtigsten Oxidationsprodukte von α-Tocotrienol aus rea­len Fettmatrices (thermisch oxidiertes Schweineschmalz und Weizenkeimöl) und aus α-toco­trienolreichen Lebensmitteln (Roggenbrot und Trockentreber) isoliert, mit HPLC/DAD/F iden­tifiziert und auch geringe Gehalte an α-Tocotrienoloxidationsprodukten in den Lipidmatrices von weniger als 0,78 µg/g quantifiziert werden. Mithilfe der HPLC/MS und von weiteren spektroskopischen Methoden konnten neue Oxidationsprodukte identifiziert werden: einzeln in n-Hexan thermisch oxidiertes β-, γ- und δ-Tocotrienol bildete jeweils Dimere als Haupt­oxidationsprodukte. Um erste Informationen über den physiologischen Effekt von Tocotrienoloxidationsprodukten zu erlangen, wurden humane MCF-7-Brustkrebszellen 72 h lang mit thermisch oxidierten Tocotrienoltestsubstanzen (α-Tocotrienol, γ-Tocotrienol, oder einer tocotrienolreichen Fraktion aus Palmöl) behandelt und deren Effekt auf die Viabilität der Zellen mit dem von nichtoxidier­ten Testsubstanzen verglichen. Die Ergebnisse der Viabilitätsassays (d. h. des alamarBlue-Tests) lassen den Schluss zu, dass die Viabilität der Brustkrebszellen in vitro durch Oxidati­onsprodukte von γ-Tocotrienol reduziert werden kann.

Das zweite untersuchte Lebensmittel war Eigelb, welches durch die ganz spezifische Struk­tur der Eigelbproteine über besondere lebensmitteltechnologische und physiologische Ei­genschaften, wie die hitzeinduzierte Gelbildung und eine Antikörperwirkung, verfügt. Um die­sen Zusammenhang besser zu verstehen, wurden zunächst hitzeinduzierte Veränderungen im Eigelb und seiner Hauptfraktion LDL mittels Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektros­kopie und Rheometrie unter­sucht. Veränderungen in der Sekundärstruktur (Ausbildung von β-Sheets durch Protein­aggregation) konnten mit bestimmten Änderungen im charakteristi­schen Viskositäts­verlauf des Eigelbs korreliert werden. Beide analytischen Methoden zeig­ten, dass eine Erhö­hung der Ionenstärke durch Zugabe von Kochsalz die thermische Stabi­lität von Eigelbprotei­nen erhöhte. Auch für die LDL-Fraktion galten die oben genannten Zusam­menhänge, sofern die Probe Kochsalz enthielt. Durch ein spezielles, schonendes Gefriertrocknungsverfahren wurde zwar die Sekundärstruktur von LDL-Proteinen beeinträch­tigt, aber nicht deren rheologische Eigenschaften. Die Livetinfraktion des Eigelbs hat durch ihren Gehalt an Anti­körpern (Immunglobulin Y; IgY) eine besondere biologische Funktiona­lität. Die Livetinfraktion wurde erstmals umfassend mittels FTIR-Spektroskopie charakteri­siert, indem ihre Protein­sekundärstruktur mit der von den Livetinkomponenten α- und γ-Livetin verglichen und der Einfluss einer technologischen Behandlung einschließlich der Er­hitzung auf die Protein­sekundärstruktur bestimmt wurde. Es zeigte sich, dass die neu entwi­ckelte TOD (FTIR)-Methode gut geeignet ist, die Grenzen der Thermostabilität von Livetinen zu beschreiben, was unter Anwendung der komplementären ELISA-Methode untermauert wurde. Die Gefriertrocknung führte beispielsweise zu Livetinprodukten mit einer höheren Thermostabilität als die Sprüh­trocknung. Abschließend wurde der Einfluss der Bebrütung auf die Sekundärstruktur der Ei­gelbproteine, welche eine herausragende Rolle bei der Entste­hung eines lebenden Kükens spielen, untersucht. Die FTIR-Analytik zeigte, dass die Protein­konformation der Volleigelb- und Granulaproben in der frühen Brutphase trotz der zwei poten­ziellen Ein­flussfaktoren, nämlich (1) signifikante pH-Wert-Erhöhung und (2) Eisen­freisetzung aus dem Phosphoprotein Phosvitin, stabil blieb. Im Gegensatz zu Volleigelb und Granula, wurde je­doch im Eigelbplasma bebrüteter Eier an den Tagen 3 und 4 Verände­rungen in der Protein­sekundärstruktur entdeckt, was mit dem Einstrom von Eiklarproteinen erklärt werden konnte; der Einsatz der komplementären IEF-Methode stützte die aus den FTIR-Ergebnissen gezo­genen Schlüsse.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse aller Studien, dass wesentliche Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen der Molekülstruktur und den funktionellen Eigenschaften von Inhalts­stoffen aus Gerste (Tocotrienole) und Eigelb (Proteine) gewonnen wurden. Damit konnten wichtige Beiträge für eine optimale Nutzung der lebensmitteltechnologischen und physiologi­schen Funktionen dieser Lebensmittelinhaltsstoffe erarbeitet werden. Dies schafft die Vo­raussetzungen dafür, dass z. B. zukünftig Tocotrienole aus heimischer Gerste als antioxidativ wirksame Lebensmittelzusatzstoffe oder in Functional Food-Produkten bzw. Pharmazeutika mit cholesterinsenkenden oder antikanzerogenen Eigenschaften eingesetzt werden können. Außerdem kann das vertiefte Verständnis über den Zusammenhang zwi­schen Proteinsekundärstruktur und Funktionalität in Zukunft dazu genutzt werden, die nach einem neuartigen Verfahren hergestellte Eigelbfraktion LDL gezielt aufgrund ihrer durch Proteine vermittelten Gelbildungseigenschaften für lebensmitteltechnologisch anspruchsvolle Produkte wie beispielsweise Sauce Hollandaise einzusetzen bzw. die Eigelbfraktion Livetine aufgrund ihrer vom IgY-Gehalt ausgehenden, genau steuerbaren Antikörperwirkung z. B. gegen Helicobacter pylori-Infektionen oder Zahnkaries im Functional Food- bzw. Medizinbe­reich zu etablieren.

 

Summary

The function of a food ingredient is always linked with its molecular structure. The over­arching objective of the studies summarized in this postdoctoral thesis was to describe the rela­tionship between these two variables by determining the effects of technological treat­ments on molecular structure and on techno-functional and physiological properties, and by corre­lating these effects. Understanding this relationship would contribute to the optimization of the functional properties of food or pharmaceuticals.

One foodstuff investigated was barley, which is unique due to the particular composition of its vitamin E spectrum of tocotrienols, which have interesting positive physiological and techno-functional properties and comprise a particularly large proportion (70%) of total vitamin E (consisting of the eight tocochromanols; α-, β-, γ-, and δ-tocopherol; and α-, β-, γ-, and δ-tocotrienol). Tocotrienols are thought to have, e. g., anti-cancer, hypocholesterolaemic, and antioxidative properties. Dried brewer’s spent grain (DBSG), a by-product of the brewing industry available in large quantities, is considered to be the richest European source of tocotrienols by far. Nevertheless, there is as yet no marketable tocotrienol extract from DBSG. After the brewing process, the tocotrienols remain in the insoluble spent grain, which therefore has a higher tocotrienol level than that of whole malting barley kernels. The first challenge was to extract the tocotrienols from the feedstuff while preserving their mo­lecular structure. It was shown (1) that milled DBSG sieving fractions with particle sizes<  500 µm were the most suitable for ethanolic tocotrienol extraction, and (2) that the protein contents positively correlate with tocochromanol levels of different sieving fractions of the samples. It was determined by HPLC with fluorescence (F) detection that the concentrations of tocotrienols in the oils were in the range of 516.8–850.2 mg/kg, which are higher than those of palm oil, which is known for its high tocotrienol levels. This newly developed method for the extraction of tocotrienols from DBSG is expected to be economically feasible on an in­dustrial scale.

Moreover, a human study was conducted to compare the bioavailability and pharmaco­kinetics of orally administered tocotrienols 0–24 h after a single dose of 450 mg total tocotrienols from α-tocotrienol-rich barley oil and γ-tocotrienol-rich palm oil (both also low in tocopherols). Analysis of tocochromanols in blood plasma by HPLC/F and determination of metabolites in urine by HPLC/MS revealed that the composition of the tocotrienol spectrum in the sample affects the bioavailability of the single vitamer. In particular, low-level (or absent) α-tocopherol is known to be a key determinant for the enhanced absorption of ingested tocotrienols. The data proved that the absorption of total tocotrienols from barley oil was sig­nifi­cantly higher than from palm oil, due to the higher percentage in the barley oil of α-tocotrienol, which is known to have the highest bioavailability among the tocotrienol vitamers. As the human study showed that emulsifying the tocotrienol-rich palm oil formulation en­hanced the bioavailabilty of total tocotrienols, this treatment was also applied in tocotrienol-rich barley oil formulations, and the effect of emulsification was tested using the model “feed→hen→egg”. Firstly, the transfer efficiency of tocotrienols from barley oil was higher than from palm oil; secondly, emulsification of tocotrienols from barley oil led to higher total con­tents per egg than with tocotrienols from non-emulsified formulations.

When tocotrienols act as antioxidants, they are oxidized and form oxidation products them­selves. A newly developed molecular distillation method made it possible to isolate the most important α-tocotrienol oxidation products formed in real lipid matrices (thermally oxidized lard and wheat germ oil) and in α-tocotrienol-rich food (rye bread and DBSG). The oxidation products were identified by means of HPLC/DAD/F and quantitated at levels below 0.78 µg/g. With the help of HPLC/MS and further spectroscopic methods, as yet unknown oxidation products were identified; dimers were the only major oxidation products when β-, γ‑, and δ-tocotrienol were thermally oxidized individually in n-hexane solution. In order to conduct a preliminary test on the physiological effect of tocotrienol oxidation products, human MCF-7 breast cancer cells were treated with oxidized test compounds (α-tocotrienol, γ-tocotrienol, or a tocotrienol-rich fraction from palm oil) for 72 h, and the effect on the viability of cells was compared with that of non-oxidized test compounds. The results of the viability assays (i. e., the alamarBlue assay) suggest that the viability of breast cancer cells in vitro can be decreased by γ-tocotrienol oxidation products.

Another foodstuff investigated was egg yolk, which has particular techno-functional (e. g., heat-induced gelation) and physiological (e. g., antibody) properties due to the specific mo­lecular structure of the egg yolk proteins. In order to reach a better understanding of the rela­tionship between those two variables, heat-induced changes in egg yolk and its main frac­tion, LDL, were investigated by means of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and rheology. Changes in the protein sec­ondary structure (formation of β-sheets due to aggrega­tion of proteins) were correlated with distinct changes in the characteristic egg yolk viscosity curve progression. Both analytical methods indicated that the presence of ionic strength (i. e., NaCl) increased the thermal sta­bility of egg yolk proteins. This relationship also applied to the LDL fraction, provided that a minimum ionic strength (NaCl) was present. It was shown that the recently developed, opti­mized freeze-drying method impaired the pro­tein secondary structure of LDL but not its rheo­logical properties. As the egg yolk livetins fraction contains the IgY antibodies, it therefore has a particular biological functionality. For the first time, the recently developed livetins for­mulation was comprehensively characterized by comparing its protein secondary structure with those of the reference substances α- and γ-livetin and by determining the impact of technological treatments including heating on the protein sec­ond­ary structure by means of FTIR. It was shown that the newly developed TOD (FTIR) method is a useful tool to describe the limit of heat stability of livetins, and the re­sults were also confirmed by ELISA. It was found for example that the thermostability of freeze-dried livetins formula­tions was higher than that of the spray-dried ones. Finally, the effect of incubation on the secondary structure of egg yolk proteins was determined, as egg yolk proteins play a par­ticular role in the development of a living chick. FTIR showed that the protein conformation in whole egg yolk and granules was stable during the first eight days of incubation, although (1) the pH value significantly increased, and (2) iron was released from the phosphoprotein phosvitin in this time period. These two factors had previously been as­sumed to have a potential impact on the protein structure. However, in the plasma fraction (but not in whole egg yolk and granules) of incu­bated eggs, changes in the protein secondary structure oc­curred at days 3 and 4 of incuba­tion, due to the physiological influx of albumen into the yolk sac, and these FTIR findings were confirmed by results of the conventional IEF method.

In summary, the results of all studies covered in this thesis show an increase in fundamental knowledge about the relationship between molecular structure and the functional properties of ingredients from barley (tocotrienols) and egg yolk (proteins), leading to important contri­butions toward the optimal utilization of the food technological and physiological functions of these food ingredients. This is the prerequisite for the future application of tocotrienols from European barley as an antioxidative food additive or in functional foods or pharmaceuticals with cholesterol-lowering or anti-carcinogenic properties. Furthermore, the deeper under­standing of the relationship between protein secondary structure and functionality may be used to apply the recently developed egg yolk fraction LDL, for example by utilizing the pro­tein-induced gel forming properties for specialty products such as hollandaise sauce. Other applications would be to establish the recently developed livetins fraction in functional foods or in medicine, since the livetins fraction contains the IgY antibodies, which can be produced to exhibit specific properties to combat widespread health concerns such as Helicobacter pylori infections or tooth decay.

 

keywords

Gerstenbiertreber, Tocotrienole, HPLC, Eigelbfraktionen, Proteine, FTIR, brewer´s spent grain, tocotrienols, HPLC, egg yolk fractions, proteins

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