HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Jessika-Maximiliane Veronika Cavalleri

 

Untersuchungen zur Immuntherapie des equinen malignen Melanoms unter

besonderer Berücksichtigung der immunologischen Therapieantwort und der

antitumoralen Effekte der Zytokingentherapie mit den equinen Interleukinen 12

und 18 sowie der therapeutischen DNA-Vakzinierung gegen humane Tyrosinase

und humanes Glykoprotein 100

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2774

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2010

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_cavalleri16.pdf

engl.

Investigation of immunotherapeutic aspects treating equine malignant melanoma with an emphasize on the immunological response to and the antitumoral effect of a cytokine gene therapy utilizing equine interleukin 12 and 18 and a therapeutic DNA vaccination against human tyrosinase and human glycoprotein 100

 

Zusammenfassung

Das equine maligne Melanom ist einer der häufigsten Hauttumore beim Pferd. Zufriedenstellende systemische Therapien existieren bislang nicht, jedoch zeigen immuntherapeutische Ansätze ähnlich wie bei der Therapie von humanen und kaninen malignen Melanomen die bislang vielversprechendsten Erfolge. Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Untersuchung der klinischen Wirksamkeit und der immunologischen Effekte von unspezifischen Zytokingentherapien mit den equinen Interleukinen 12 und 18 und spezifischen Tumor-DNA-Vakzinen kodierend für die melanozytären Differenzierungsantigene humane Tyrosinase oder humanes Glykoprotein 100 bei an Melanomen erkrankten Pferden.

Die Ergebnisse der durchgeführten klinischen Studien an melanomkranken Pferden lassen den Schluss zu, dass die experimentelle Zytokingentherapie mit equinem Interleukin-12 und equinem Interleukin-18 allein und in Kombination eine klinische Wirksamkeit gegen equine Melanome zeigt, wobei dieser Therapieerfolg individuell variabel ist und nur eine begrenzte Reduktion des Tumorvolumens erreicht wird. Die Therapie führte zu einer Stabilisierung der Tumoren, nicht aber zu einer Tumorregression. Die behandelten Pferde tolerierten die Therapie gut. Mit der Kombinationstherapie der beiden Interleukingene (IL-12 und IL-18) konnte erstmals auch beim Pferd eine systemische Wirkung der Therapie gezeigt werden. Zur Charakterisierung der resultierenden Therapieantwort wurde der Nachweis einer Interferon-gamma-Expression nach intratumoraler Injektion von Interleukin-12-Plasmiden im injizierten Tumorgewebe geführt. Dieser wies auf die Induktion einer Th1-Antwort durch die Therapie hin.

Die begrenzte Wirksamkeit der Zytokingentherapie war möglicherweise auf eine geringe Transfektions­effizienz der Plasmid-DNA zurückzuführen. Dementsprechend war die Optimierung der Transfek­tionseffizienz der therapeutischen DNA-Konstrukte Ziel nachfolgender In-vitro-Arbeiten. Hiermit sollten zunächst Grundlagen für eine In-vivo-Anwendung verbesserter Transfektionsmechanismen erbracht werden. Um Nanopartikel als mögliche Optimierung der Transfektionseffizienz in Betracht zu ziehen, wurden zunächst die Transfektionseffizienz, aber auch die Zytotoxizität verschiedener Goldnanopartikel und Magnetnanopartikel in der Zellkultur getestet. Die konventionelle Transfektion mit lipophilen Transfektions­reagenzien wurde durch Goldnanopartikel-vermittelte Transfektionsmethoden verbessert. Die Zytotoxizität war abhängig von dem Expressionsvektor (Interleukin-12 oder rHMGB1). Die Untersuchungen belegten, dass Laser-induzierte Goldnanopartikel die Transfektionseffizienz bei geringer Zytotoxizität erhöhen konnten. Durch diese In-vitro-Studien wurde eine Basis für weitere In-vivo-Forschung an Pferden geschaffen.

Wie oben erläutert, führte die kombinierte Zytokingentherapie mittels intradermaler und intramuskulärer Injektion von linearen DNA-Vektoren kodierend für die equinen Interleukine 12 und 18 in Formulierung mit einem amphiphilen Transfektionsreagenz klinisch zu einer systemischen, antitumoralen Wirkung. Entgegen den Erwartungen wurde dieser Effekt jedoch nicht weiter durch die Addition xenogener Tumor-assoziierter Antigen-DNA verstärkt, sondern führte ähnlich wie die Zytokingentherapie mit den einzelnen Interleukinen nur zu einer Reduktion des Tumorvolumens, die nach den RECIST-Kriterien für immunologische Therapien als stabile Erkrankung definiert wird. Deshalb wurde in einem weiteren Schritt die Charakterisierung von pferdespezifischen Immunreaktionen auf diese linearen DNA-Vektoren untersucht. Ziel war dabei zu ermitteln, ob die Expressionskassette für potenzielle Therapieerfolge entscheidend ist.

In einem ersten Schritt wurde zunächst ein simultaner Mikrosphären-basierter Assay zur Quantifizierung von equinem Interleukin-12 und Interferon gamma etabliert, um die Expressionsfähigkeit der untersuchten equinen Interleukin-12-DNA-Vektoren auf Proteinebene untersuchen zu können und auch um die biologische Funktionalität durch die Detektion des nachgeschalteten IFNg zu überprüfen. Für die weitere Charakterisierung der Effekte durch die untersuchte Zytokingentherapie wurde nach Nachweismethoden für relevante equine Zytokine gesucht. Die Funktionalität von sieben monoklonalen Antikörpern gegen die equinen Zytokine IL-1b, IL-18 und GM-CSF konnte mit verschiedenen Methoden (Dot Blot, Western Blot, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie) nachgewiesen werden. Diese Antikörper stehen damit zur weiteren Nutzung zur Verfügung. Mit der Etablierung dieser Methoden wurden die folgenden Untersuchungen zur Charakterisierung der Immunreaktion ermöglicht.

Um die Immunantwort auf die verabreichten mit dem kationischen amphiphilen Transfektionsreagenz SAINT-18 (Synvolox Therapeutics, Groningen, Holland) komplexierten MIDGE-Th1-DNA-Vektoren näher charakterisieren zu können, wurden zunächst verschiedene Einflussfaktoren auf die Immunreaktion von Pferden untersucht. Die Leukozytenmorphologie und die Ex-vivo-Zytokinsekretion peripherer mononukleärer Blutleukozyten von TNFa, IFNg, IL-4, IL-10 und IL-17 waren durch eine hohe interindividuelle Variabilität gekennzeichnet. Mit zunehmendem Alter waren die Leukozyten größer und die Population der neutrophilen Granulozyten war im Verhältnis zu den Lymphozyten größer. Die peripheren mononukleären Blutleukozyten der älteren Pferde ließen sich weniger gut zur Zytokinsekretion stimulieren, die basale Sekretion von TNFa, IL-4 und IL-10 stieg aber mit dem Alter an. Im Unterschied zu den untersuchten Stuten wiesen Wallache kleinere Monozyten und eine stärkere spontane Synthese von IL-10 auf. In Bezug auf den Rassetyp zeigte sich eine höhere In-vitro-Stimulierbarkeit der peripheren mononukleären Leukozyten der Warmblutpferde in der Sekretion von TNFa, IL-4 und IL-17 als bei den höher im Blut stehenden Pferden. Diese hohe interindividuelle Varianz zeigte, dass die Bestimmung individueller Ausgangswerte vor der Untersuchung einer immunologischen Reaktion auf bestimmte Stimuli (in diesem Fall komplexierte DNA) durchgeführt werden musste. Die so ermittelten Werte für Leuko­zytenzusammensetzung, -morphologie und Zytokinsekretion dienten als individuelle Ausgangswerte eines jeden Pferdes, um die Immunreaktion auf die Gentherapie von mit dem kationischen Transfektionsreagenz SAINT-18 komplexierter MIDGE-Th1-DNA beurteilen zu können. Eingeschlossen waren eine reine Vehikelkontrolle, die exprimierenden Vektoren und CG-haltige sowie CG-freie DNA. Die komplexierte DNA induzierte unabhängig von der kodierenden Sequenz und auch unabhängig von enthaltenen CG-Motiven bei gesunden Pferden lokal und systemisch eine messbare Immunantwort. Bei den Pferden, die mit Expressionsvektoren kodierend für equines IL-12 und IL-18 behandelt wurden, war diese systemische Th1-polarisierte Entzündung am stärksten. Sie exprimierten auch lokal an der intradermalen Injektionsstelle die größte Menge an CXCL-10, einem nachgeschalteten Botenstoff der IL-12-Kaskade. Auffällig war zudem die im Vergleich zu den nicht vergrauenden Pferden geringere Immunantwort der in die Untersuchung eingeschlossenen Schimmel (n=8).

Die Erkenntnisse zur klinischen Wirksamkeit und zur Immunantwort von Pferden auf die Zytokingentherapie bilden die Grundlage, um die Zytokingentherapie beim Pferd weiterzuentwickeln und neue immunologische Behandlungsstrategien des equinen malignen Melanoms, aber auch anderer equiner Tumore zu untersuchen und zu entwickeln. Die Anwendung der Methoden aus der vorliegenden Arbeit erlaubt zudem ein genaueres Immunmonitoring von Pferden und kann neben der Anwendung in der Pferdeonkologie auch für andere Bereiche der Pferdemedizin wertvoll sein.

 

Summary

The equine malignant melanoma is one of the most common equine neoplastic skin diseases. Efficient therapies exhibiting systemic antitumoural effects are still missing to date. However, immunotherapeutic strategies similar to the ones used in the therapy of human and canine malignant melanomas are the most promising options.

The aim of the herein presented studies was the determination of the clinical efficacy and immunological effects of nonspecific cytokine gene therapies using equine interleukin 12 and interleukin 18 alone or in combination with specific tumour-DNA-vaccines coding for the melanocytic differentiation antigens human tyrosinase or human glycoprotein 100 in horses suffering from spontaneous melanomas.

The results of the clinical trials in equine melanoma patients allow the conclusion that cytokine gene therapy with equine interleukin 12 and 18 (alone or in combination) shows clinical efficacy against equine malignant melanoma. Yet the response to therapy was variable in individual horses and the therapy provoked a limited reduction in tumour volume only during the monitoring period of up to 120 days. This accounts for a stable disease, but not true tumour regression in regards to the guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumours. Horses treated with cytokine genes tolerated the therapy well. After treatment with the combinatorial therapy of IL-12 und IL-18 systemic antitumoural effects of the therapy were demonstrated for the first time in horses. To obtain first answers on the characteristics of the resulting response to therapy and as a support of the biological function of the IL-12-plasmid interferon gamma (IFNg) expression was determined after intratumoural injection by quantitative real-time PCR in the tumour tissue. The induction of IFNg supports the stimulation of a Th1 polarized immune reaction in response to the IL-12-plasmid-therapy.

It was hypothesized that a reason for the limited efficacy of the cytokine gene therapy could be traced back to a suboptimal transfection efficiency of the plasmid DNA-vector. Therefore, the following in vitro work aimed at optimizing the transfection efficiency of the therapeutic DNA-vectors in order to set a foundation for further in vivo implementations of improved transfection mechanisms. One potential option to advance transfection efficiency is the use of nanoparticles as enhancers of transfection. Hence, in vitro gold nanoparticle-mediated transfection and magnetofection were compared to a conventional lipofection method and evaluated in regard to their respective transfection efficiency and cytotoxicity. The gold nanoparticle-mediated transfection enhanced the transfection efficiency compared to the lipofection method. The cytotoxic potential of the transfection methods differed depending on the type of the transfected DNA construct (interleukin 12 or rHMGB1) and on the type of gold nanoparticles used. Laser-generated gold nanoparticles improved the transfection efficiency of plasmid DNA-vectors while limiting the cytotoxicity. These in vitro experiments are the foundation for further research on DNA transfection of horses in vivo.

The clinical study in 27 melanoma bearing horses indicated that the combination of interleukin 12 and 18 DNA-SAINT-18-complexes injected intradermally and intramuscularly lead to a systemic antitumoural effect. Treated horses displayed stable disease (as defined in the Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria [181]) over the monitoring period of 120 days. However, the hypothesis of enhancing the effect by adding a xenogeneic DNA vaccine (human tyrosinase or glycoprotein 100, respectively) was rejected. No difference between outcomes was seen in the vaccination groups as opposed to the interleukin group. Consequently, the successive study was aimed at characterizing the immune reaction of horses to linear DNA vectors complexed with the amphiphilic transfection reagent in order to answer the question whether the expression cassette (interleukin 12 and interleukin 18) was necessary for the potential therapeutic success. As a prerequisite several immunological assays for equine cytokines had to be established. A bead-based assay allowing simultaneous quantification of equine IL-12 and IFNg was established so as to be able to determine the biological function of in vivo transfected equine interleukin 12 DNA by detection of IL-12 and its downstream mediator IFNg on the protein level. To further characterize the immune effects of the cytokine gene therapy the reactivity of commercially available antibodies to relevant cytokines for cross-reactivity with the respective equine cytokines was assessed. Out of 15 antibodies tested, seven monoclonal antibodies reacted with the equine cytokines IL-1b, IL-18, and GM-CSF, respectively, in one or more of the performed assays (Dot Blot, Western Blot, immunohistochemistry and flow cytometry). These antibodies are available for further research in equine immunological subjects. The establishment of aforementioned methods allowed their use in the main investigation aiming at the characterization of the immune reaction to linear DNA complexed with a transfection reagent. Analysing the baseline values of 24 healthy horses in regard to leukocyte counts, leukocyte composition, morphology and ex vivo cytokine secretion of peripheral blood mononuclear cells of TNFa, IFNg, IL-4, IL-10 and IL-17 a wide variance was revealed. Age and sex were the main influencing factors that were identified. Older horses showed larger leukocytes and a higher proportion of neutrophils as opposed to younger horses. Basal ex vivo release of TNFa, IL-4, and IL-10 was higher with older age, but those PBMC did not react as well to stimulation with mitogens. Geldings showed smaller monocytes and higher spontaneous production of IL-10 when compared to mares. The stimulation to spontaneous release ratios of Warmblood type horses were higher than in Thoroughbred type horses when considering ex vivo secretion of TNFa, IL-4, and IL-17. In conclusion, these high interindividual variances argue for individual baseline measurements in the investigation of an immunological reaction to certain stimuli (e.g. complexed DNA constructs). Baseline values obtained in the 24 horses were used to evaluate individual responses to the gene therapy with MIDGE-Th1-DNA-vectors complexed with the cationic amphiphilic transfection reagent SAINT-18 (Synvolox Therapeutics, Groningen, The Netherlands). Included in the study were a vehicle control, the interleukin 12 and 18 expressing vectors, CG-motif containing nonsense-DNA, and CG-motif free nonsense-DNA. Independent from its coding sequence, and independent from the presence of CG-motifs, also, in healthy adult horses the DNA complexes induced a local and systemic immune reaction. The group of horses treated with IL-12 and IL-18 expressing DNA (n=6) showed the most severe signs supporting a Th1-polarized systemic inflammatory reaction. In addition, they expressed the highest amounts of CXCL 10, a downstream mediator of the IL-12 cascade, in the skin of the intradermal injection site. An additional result from this study was the fact that grey horses showed a less marked immune response than the horses of different colours.

In conclusion, the results of this thesis can be the foundation for further investigations in the field of immunotherapy in equine oncology and allow for better immune monitoring in equine patients. Furthermore, applying the methods established herein allows the investigation and development of new therapeutic strategies, not only against the equine malignant melanoma but also against other equine tumours.

keywords

Horse, oncology, immunotherapy. Pferd, Onkologie, Immuntherapie

kb

20.808