HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Andreas A. Beineke

 

Bedeutung der akuten Neuroinflammation bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems für die Initiation und Progression von Entmarkungsprozessen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2574

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2012

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_beineke12.pdf

Zusammenfassung

Die Hundestaupe und Theilersche murine Enzephalomyelitis (TME) stellen spontan auftretende bzw. experimentelle Modelle für demyelinisierende Krankheiten dar. Während die Demyelinisierung im chronischen Stadium der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen durch eine myelinspezifische Autoimmunität hervorgerufen wird, sind die immunologischen und neurodegenerativen Abläufe während der Initialphase dieser Krankheit weitgehend unklar. Ziel der vorliegenden Arbeiten war daher eine nähere Charakterisierung der neuropathologischen Prozesse während der akuten Phase von virusinduzierten Krankheiten des zentralen Nervensystems (ZNS) und die Identifikation von Faktoren, die immunpathologische Vorgänge und Myelinveränderungen induzieren. In der Frühphase der Hundestaupe konnte im Großhirn eine dominierende Expression der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-6, IL-8, IL-12 und Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a) durch residente Zellen nachgewiesen werden. Der Mangel an immunregulatorischen Zytokinen führte hierbei möglicherweise zu einem immunologischen Ungleichgewicht mit assoziierten neuroinflammatorischen Prozessen im weiteren Krankheitsverlauf. Zur Detektion von universellen Reaktionsmustern residenter ZNS-Zellen bei verschiedenen Morbillivirusinfektionen wurde die zelluläre Immunantwort im Großhirn bei der Seehundstaupe phänotypisiert. Diesbezüglich wurden in einer Pilotstudie zunächst verschiedene Leukozytenmarker auf ihre Kreuzreaktivität mit phozinem lymphatischen Gewebe getestet. Wie bei der Hundestaupe konnte bei der Seehundstaupe eine primäre Infektion von Neuronen in Verbindung mit einer frühzeitigen Aktivierung residenter Zellen im Großhirn nachgewiesen werden. Zur näheren Analyse der Funktion der Mikroglia wurden in Analogie zu den Untersuchungen bei viralen ZNS-Krankheiten immunologische Abläufe im traumatisierten Rückenmark und in organotypischen spinalen Schnittkulturen in vitro beim Hund analysiert. Vergleichbar mit den Prozessen bei der Hundestaupe fand sich eine vorwiegende Expression proinflammatorischer Zytokine, während neuroprotektive Zytokine nicht (IL-10) oder erst verzögert (Transformierender Wachstumsfaktor-b) aufreguliert wurden. Basierend auf der hieraus abgeleiteten Hypothese, dass eine Dysregulation der Immunhomöostase durch Virusinfektionen während der akuten Krankheitsphase immunpathologische Prozesse initiiert, wurden anschließend neuropathologische Vorgänge und immunologische Parameter unter experimentellen Bedingungen bei der TME näher untersucht. Hierbei konnten im Mausmodell deutliche Parallelen mit der Läsionsentwicklung in MS-Patienten sowie bei der Hunde- und Seehundstaupe nachgewiesen werden. Der Vergleich suszeptibler SJL- und resistenter C57BL/6-Mäusen zeigte außerdem, dass die Infektion von Oligodendrozyten und Mikroglia/Makrophagen eine essentielle Voraussetzung für die Viruspersistenz und Demyelinisierung darstellt. Zur weiteren Charakterisierung des Einflusses des peripheren Immunsystems auf die Initiation der Neuroinflammation bei der TME wurden Genexpressionsanalysen durchgeführt. Im Zusammenhang mit der virusinduzierten Polioenzephalitis konnte eine transiente Expression von Genen vorwiegend im Zervikallymphknoten während der akuten Infektionsphase nachgewiesen werden. Eine funktionelle Analyse der Daten zeigte einen deutlichen Zusammenhang der differentiell exprimierten Gene mit der B-Zellimmunität, Antigenpräsentation und Aktivierung des Komplementsystems. Die Ergebnisse sprechen für eine virusinduzierte Reaktion in den regionären Lymphknoten des Gehirnes. Möglicherweise stellt die initiale B-Zellaktivierung eine Voraussetzung für antikörpervermittelte Myelinschäden und eine Kompartimentalisierung der Immunantwort im ZNS während der demyelinisierenden TME-Phase dar. Zur näheren Klassifizierung der lokal im Gehirn ablaufenden immunologischen Prozesse während der akuten TME-Phase und deren Bedeutung für die Krankheitsprogression wurde eine Phänotypisierung der zellulären Immunantwort und Zytokinexpressionsanalyse durchgeführt. Der Vergleich unterschiedlicher Mäusestämme zeigte hierbei eine deutliche Infiltration von Foxp3+-regulatorischen T-Zellen und CD45R+-B-Zellen im Gehirn von suszeptiblen SJL-Mäusen in Verbindung mit einer erhöhten Transkription von IL-10. Im Gegensatz hierzu zeigten resistente C57BL/6-Mäuse eine deutlich erhöhte TNF-a-Expression während der frühen akuten Infektionsphase, was mit einer beschleunigten Viruselimination im weiteren Krankheitsverlauf vergesellschaftet war. IL-10 stellt hierbei potentiell einen entscheidenden Faktor für die reduzierte bzw. verzögert einsetzende protektive TMEV-spezifische Immunantwort im Gehirn von SJL-Mäusen dar. Außerdem unterstreichen die Ergebnisse die entscheidende Bedeutung der frühen akuten Infektionsphase für die Progression der Demyelinisierung. Hierbei stellt sich die Frage, inwieweit eine Änderung des Mikromilieus im ZNS immunmodulatorische Prozesse und damit den Verlauf virusbedingter Entmarkungskrankheiten beeinflusst. Zur Klärung wurde in einem weiteren experimentellen Ansatz der toxische Effekt von Cuprizon auf den klinischen Verlauf und die spinale Entmarkung bei der TME untersucht. Durch das Neurotoxin konnten oligodendrogliale Veränderungen mit Apoptosen und einer reduzierten mRNA-Expression des basischen Myelinproteins, allerdings keine Entmarkung im Rückenmark nachgewiesen werden. Die Befunde sprechen für das Vorliegen von topograpischen Unterschieden sowohl in der Intensität von Myelinopathien als auch in der Regenerationsfähigkeit des ZNS. Bei der TME führte Cuprizon zu einer temporären klinischen Verbesserung und reduzierten demyelinisierenden Leukomyelitis in Verbindung mit einer verminderten zellulären Infiltration und Zytokinexpression im Rückenmark. Im Gegensatz zu rein immunsuppressiven Therapieansätzen führte das Neurotoxin scheinbar zu einer selektiven Hemmung der immunpathologischen Prozesse bei erhaltener protektiver Immunität. Die Untersuchungen verdeutlichen die besondere Bedeutung der Frühphase von viralen und degenerativen ZNS-Krankheiten für die Initiation von immunpathologischen Prozessen. Im Hinblick auf zukünftige immunmodulatorische Strategien und Zelltransplantationen zur Therapie von chronischen ZNS-Krankheiten müssen allerdings krankheits- und tierartspezifische Besonderheiten, die auf die unterschiedliche Modulation durch Mikrogliazellen und das periphere Immunsystem zurückzuführen sind, berücksichtigt werden.

abstract (englisch)

Canine distemper leukoencephalomyelitis and Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) represent spontaneous and experimental viral animal models for demyelinating disorders of the central nervous system (CNS). While autoimmunity leads to demyelination in the chronic progressive phase of human multiple sclerosis (MS), immunological and neurodegenerative processes during the initial disease phase are largely undetermined. Therefore, the aims of the present studies were a detailed characterization of neuropathological findings during the acute phase of virus-induced CNS disorders and identification of factors, which induce immune mediated tissue damage and myelin loss, respectively. During the early phase of canine distemper leukoencephalitis a dominating expression of proinflammatory cytokines, such as interleukin (IL)-6, IL-8, IL-12 and tumor necrosis factor (TNF)-a by resident cells of the cerebrum was detected. The lack of immune regulatory cytokines is supposed to induce a derailment of the immune response, which triggers neuroinflammation during the progressive disease stage. In order to detect equivalent reaction patterns of resident glial cells in other morbillivirus infections, cellular immune responses were phenotyped in the brain of harbor seals suffering from phocine distemper. In a pilot study a series of leukocyte markers were tested for cross reactivity with lymphoid cells of harbor seals. Similar to canine distemper infected seals exhibited a predominant infection of neurons and early activation of resident cells in the cerebral cortex. To investigate microglial function in more detail, immunological parameters have been determined in traumatized spinal cord tissue of dogs and canine organotypic spinal cord slice cultures. As observed in canine distemper, a dominating expression of proinflammatory cytokines and a lack (IL-10) or delayed (transforming growth factor-β) upregulation of neuroprotective cytokines have been observed. Based on the hypothesis, that a dysregulated immune homeostasis during early virus infection contributes to immunopathology, neuropathological lesions and immune responses have been investigated in TME, as a translational mouse model. Lesion development in infected mice was similar to that observed in MS as well as in canine and phocine distemper. Comparison of susceptible and resistant mouse strains revealed that the switch of cell tropism from neurons to microglia and oligodendrocytes represents an essential prerequisite for persistence of the TME virus and demyelination in SJL mice. To characterize the impact of the peripheral immune system upon the initiation of neuroinflammation in the TME model, global gene expression analyses have been performed. Here, associated with virus induced polioencephalitis a transient gene expression was detected in the brain draining cervical lymph node during the early acute infection phase. Functional annotation analyses revealed differential expression of genes involved in B cell immunity, antigen presentation and complement activation. Early gene expression is indicative of virus triggered immune responses in the brain-draining lymph node, which might initiate antibody mediated myelin damage and a compartimentalization of CNS-inflammation during the chronic TME phase. For further classification of local immune responses in the brain during acute infection, phenotyping of infiltrating immune cells and cytokine expression analyses have been performed. Comparison of mice with different mouse strains, revealed a prominent infiltration of Foxp3+ regulatory T cells and CD45R+ B cells associated with the mRNA expression of IL-10 in the brain of susceptible SJL mice. In contrast, an early increase of TNF-a mRNA transcription was associated with accelerated TME virus elimination in resistant C57BL/6 mice. Accordingly, IL-10 represents a potential candidate molecule for the impaired antiviral immunity and virus persistence in mice with a susceptible genetic background. Furthermore, results substantiate the hypothesis that an imbalanced cytokine milieu during the early infection phase contributes to immune mediated demyelination in the chronic phase. This raised the question about the impact of neurodegenerative changes upon immunmodulatory mechanisms in infectious MS models. In a subsequent experiment, the effect of the neurotoxin cuprizone upon the clinical course and spinal demyelination was tested in TME virus infected mice. Cuprizone induces oligodendroglial alterations with apoptosis induction and reduced myelin basic protein expression, but without overt spinal demyelination, which substantiates the concept of major morphological and functional regional differences between brain and spinal cord. In TME virus infected mice cuprizone causes a temporary improvement of clinical signs and reduced demyelinating leukomyelitis despite toxic myelin damage in the corpus callosum. This process was associated with reduced infiltration of leukocytes and decreased expression of pro- and anti-inflammatory cytokines in the spinal cord. This phenomenon is supposed to be a consequence of selective inhibition of detrimental inflammatory responses with maintained protective immunity against the virus. In summary, the present studies highlight the importance of early inflammatoty responses for the pathogeneses of progressive demyelination. However, disease phase and species specific properties, such as differences of modulatory effects of microglial cells and the peripheral immune system, have to be taken into consideration for future immunoregulatory strategies and cell transplantation approaches for the treatment of chronic CNS disorders.

keywords

Multiple Sklerose, Hundestaupevirus, Theilervirus; Multiple sclerosis, canine distemper virus, theilervirus

kb

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