HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Christoph Georg Baums

 

Oberflächen-assoziierte und sezernierte Faktoren

von Streptococcus suis in der

Epidemiologie, Pathogenese und Impfstoffentwicklung

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2479

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_baums09.pdf

Zusammenfassung

S. suis gehört zu den wichtigsten bakteriellen Krankheitserregern des Schweins. Weiterhin hat S. suis als Zoonoseerreger, vor allem in Asien, eine zunehmende Bedeutung in der Humanmedizin erlangt. Meningitis, Septikämie, Arthritis, Serositis und Bronchopneumonie sind häufige Manifestationen beim Schwein. S.-suis-Infektionen des Menschen äußern sich meistens in Meningitis, Septikämie oder Endokarditis. Klinisch unauffällige Trägertiere spielen für die S.-suis-Epidemiologie eine herausragende Rolle. Der Erreger zeichnet sich durch eine große Diversität aus, die unter anderem in der Ausbildung von mindestens 33 unterschiedlichen Kapselserotypen zum Ausdruck kommt. Zu Beginn dieser Arbeit war die Kapsel der einzige nachgewiesene Virulenzfaktor von S. suis. Durch den Nachweis des muramidase-released proteins (MRP) und des extracellular factors (EF) konnten bereits drei wichtige Phänotypen unter Serotyp-2-Stämmen differenziert werden, die sich in ihren virulenten Eigenschaften unterschieden. Experimentelle Untersuchungen konzentrierten sich auf MRP+ EF+ Serotyp-2-Stämme, die sich durch eine hohe Virulenz auszeichnen. In Impfstoffversuchen konnte eine partielle Protektion von Ganzzellvakzinen gegenüber diesem Pathotypen nachgewiesen werden. Es war jedoch weder bekannt, wie diese Schutzwirkung zustande kommt, noch ob sich diese Wirkung auch auf andere Serotypen erstreckt.

In dieser Arbeit sollte vor allem das relativ enge Spektrum der experimentellen S.-suis-Forschung erweitert werden, um grundlegend neue Fragestellungen bearbeiten zu können. Für diese Zielsetzung wurden folgende Arbeitspunkte definiert:

  • Differenzierung und Charakterisierung von S.-suis-Pathotypen in epidemiologischen Untersuchungen
  • Etablierung von Infektionsmodellen für die beiden wichtigsten invasiven Pathotypen in Europa mit klinischen, pathohistologischen und bakteriologischen Analyse-Parametern
  • Identifikation und Charakterisierung eines neuen Virulenzfaktors von S. suis unter besonderer Berücksichtigung der Erreger-Wirt-Interaktion
  • Vergleich unterschiedlicher Immunisierungsstrategien mit einer qualitativen und quantitativen Analyse der humoralen Immunantwort in homologen und heterologen Belastungsversuchen

Leitfaden durch alle Arbeitspunkte waren bestimmte auf der Bakterienoberfläche lokalisierte oder sezernierte Faktoren von S. suis, die mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind. Aus diesem Arbeitsprogramm konnten folgende Ergebnisse gewonnen werden:

Circa 40% der S.-suis-Erkrankungen in Norddeutschland werden durch zwei S.-suis-Genotypen hervorgerufen, mrp+ epf+ sly+ cps2 und mrp* epf- sly+ cps9. Diese Genotypen zeichnen sich nach AFLP-Analysen durch eine hohe Homogenität aus. In MLST-Untersuchungen konnte die Assoziation von mrp+ epf+ sly+ cps2 Stämmen mit dem klonalen ST1-Komplex bestätigt und die Assoziation von mrp* epf- sly+ cps9 mit dem ST87-Komplex erstmals postuliert werden. Vergleichende epidemiologische Untersuchungen zwischen der Haus- und Wildschwein-assoziierten S.-suis-Population legten nahe, dass beide Genotypen durch die Haltungsbedingungen (oder durch die genetischen Veränderungen) des Hausschweins selektioniert wurden. Die oben genannten invasiven Genotypen konnten zwar, mit einer Ausnahme, beim Wildschwein nicht nachgewiesen werden, es war aber eine hohe Prävalenz (10%) von mrp+ epf* sly+ cps2 Stämmen festzustellen. Diese Stämme mussten als humanpathogen eingestuft werden, da sie nach den Ergebnissen umfangreicher Genotypisierungen identisch bzw. sehr ähnlich waren zu einem Liquor-cerebrospinalis-Isolat eines erkrankten Jägers.

S.-suis-Stämme des Genotyps mrp+ epf+ sly+ cps2 exprimierten einen Oberflächen-assoziierten Serumtrübungsfaktor (opacity factor of S. suis, OFS) mit Homologie zum serum opacity factor von S. pyogenes. Die Serumtrübungsfunktion wurde durch die N-terminale Domäne von OFS vermittelt. Noch nicht veröffentlichte Ergebnisse zeigten weiterhin Fibrinogenbindung von OFS auf und sprachen für eine Schlüsselfunktion von OFS im Schutz vor Opsonophagozytose. Eine isogene ofs-Mutante war stark attenuiert in ihren virulenten Eigenschaften im Schwein, aber noch in der Lage den oberen Respirationstrakt zu besiedeln.

Intranasale experimentelle Infektionen von Läuferschweinen mit dem mrp* epf- sly+ cps9 Referenzstamm (A3286/94) führten im Gegensatz zu mrp+ epf+ sly+ cps2 Infektionen nur zu subklinischen Veränderungen. Durch intravenöse Applikation  konnte aber für einen Serotyp-9-Stamm (A3286/94) erstmals ein Infektionsmodell etabliert werden, in dem Morbidität, Mortalität und typische pathohistologische Veränderungen reproduziert werden konnten.

Alle drei getesteten Immunisierungsstrategien (Subunitvakzine aus Oberflächenproteinen, Ganzzellvakzine und Lebendvakzine) induzierten eine deutliche Serokonversion gegenüber dem Oberflächenprotein MRP. Die Bildung von MRP-spezifischen Antikörpern korrelierte nicht mit einer protektiven Wirkung, da weder die Subunitvakzine noch die Lebendvakzine einen signifikanten Schutz hervorriefen. Durch die Differenzierung der IgG-Isotypen (IgG1 und IgG2) konnten die unterschiedlichen Schutzwirkungen nicht erklärt werden. Weiterhin wurden durch die intranasale Applikation der Lebendvakzine Suilysin neutralisierende IgG-Antikörpertiter induziert, die nicht zu einer signifikanten Protektion führten. Der einzige Analyse-Parameter, mit dem sowohl die unterschiedliche protektive Wirkung der verschiedenen Immunisierungsstrategien erklärt werden konnte, als auch auf Einzeltierebene eine Korrelation mit dem Krankheitsverlauf beobachtet wurde, war der Titer opsonisierender Antikörper. Die durch die Applikation der Serotyp-2-Ganzzellvakzine induzierten opsonisierenden Antikörper führten zum Abtöten des homologen Serotyp-2-, aber nicht des heterologen Serotyp-9-Stammes. Interessanter Weise waren diese opsonisierenden Antikörper aber nicht gegen die Kapsel gerichtet.

 

Diese Arbeit hat durch die Identifikation und Charakterisierung eines invasiven Pathotypen (mrp* epf- sly+ cps9), eines neuen Virulenzfaktors (OFS) und eines prognostischen Indikators (Titer opsonisierender Antikörper) zum Fortschritt in der S.-suis-Forschung zur Epidemiologie, Pathogenese und Immunprophylaxe beigetragen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Funktion von OFS in der S.-suis-Pathogenese besser zu verstehen. Das Ziel einen serotypübergreifenden Impfstoff zu entwickeln wurde zwar noch nicht erreicht. Mit der Etablierung von Infektionsmodellen und Evaluierungen von Analyse-Parametern wurden jedoch gute Voraussetzungen geschaffen, dieses Problem mittelfristig zu lösen.

 

summary

S. suis is one of the most important bacterial porcine pathogens. Furthermore, S. suis has obtained increasing relevance as a zoonotic agent in human medicine, especially in Asia. Meningitis, septicaemia, arthritis, serositis and bronchopneumoniae are common manifestations in swine. S. suis infections in humans result typically in meningitis, septicaemia or endocarditis. Inapparent carrier animals play an important role in the epidemiology of S. suis diseases. This pathogen is characterized by a great diversity, as examplified by the presence of 33 different serotypes. At the beginning of this work, the capsule was the only known virulence factor of S. suis. Through detection of muramidase-released protein (MRP) and extracellular factor (EF) it was already possible to differentiate between three important phenotypes of serotype 2 strains, which possess different virulence potential. Experimental investigations concentrated on highly virulent MRP+ EF+ serotype 2 strains. Immunization trials demonstrated that partial protection against this pathotype might be induced by bacterins. However, neither the mechanism of protection was known, nor if protection against other serotypes was also elicited.

An important objective of this work was to broaden the relatively narrow area of experimental S. suis research, in order to work on different problems and new objectives. For this a number of specific milestones were defined:

  • Differentiation and characterization of S.-suis-pathotypes in epidemiological investigations
  • Establishing infection models for the two most important invasive pathotypes in Europe with clinical, pathohistological und bacteriological read out parameters
  • Identification and characterization of a novel virulence factor of S. suis with specific consideration of host-pathogen interactions
  • Comparison of different immunization strategies with qualitative and quantitative analysis of the humoral immune response in homologous and heterologous challenge experiments

Guidelines throughout the different milestones were specific surface and secreted factors of S. suis, which are associated with the virulence of this pathogen. The followings results were obtained:

Approximately 40% of S. suis diseases in Northern Germany were caused by two S. suis genotypes, namely mrp+ epf+ sly+ cps2 and mrp* epf- sly+ cps9. Isolates of these genotypes were found to share a high degree of similarity in AFLP analysis. In MLST investigations, an association of mrp+ epf+ sly+ cps2 strains with the clonal ST1-complex was confirmed and association of mrp* epf- sly+ cps9 strains with the ST87-complex was postulated for the first time. Comparative epidemiological investigations of S. suis populations associated with domesticated pigs and wild boars suggested that both genotypes were selected through the housing and raising conditions of domesticated piglets (or through their different genetics). Whereas the above mentioned invasive genotypes were, with one exception, not detectable in wild boars, a high prevalence (10%) of mrp+ epf* sly+ cps2 strains was registered. These strains had to be considered as pathogenic for humans, because comprehensive genotyping revealed that they were identical or very similar to a cerebrospinal fluid isolate from an infected hunter.

S. suis strains of the mrp+ epf+ sly+ cps2 genotype expressed a surface-associated serum opacity factor (OFS, opacity factor of S. suis) with homology to serum opacity factor (SOF) of S. pyogenes. The N-terminal domain of OFS encoded this function. Furthermore, unpublished results demonstrated fibrinogen binding of OFS and a key function in protection against opsonophagocytosis. An isogenic ofs mutant was severely attenuated in virulence in swine, but still capable of colonizing the upper respiratory tract.

In contrast to mrp+ epf+ sly+ cps2 infections, intranasal experimental infections of growers with the mrp* epf- sly+ cps9 reference strain (A3286/94) resulted only in subclinical changes. Through intravenous application of the serotype 9 strain A3286/94 it was however possible to establish for the first time an infection model, in which morbidity, mortality and typical pathohistological lesions were reproducible.

All three tested immunization strategies (subunit vaccine consisting of surface-associated proteins, bacterin and live vaccine) induced prominent humoral immune responses. However, induction of MRP-specific antibodies did not correlate with protection as the subunit and live vaccine did not elicit a significant protection. Differentiation of IgG1 and IgG2 isotypes did not allow explanation of differences in protection. Furthermore, intranasal application of the live vaccine induced suilysin neutralising IgG antibodies, which did not result in protection. The only read out parameter which explained differences in protective efficacies of the three immunization strategies was the titer of opsonizing antibodies. Furthermore, this parameter correlated well with the time that animals were free of disease after infection. Opsonizing antibodies elicited by the serotype 2 bacterin induced killing of the homologous serotype 2 strain but not the heterologous serotype 9 strain. Interestingly, these opsonizing antibodies were not directed against the capsule.

This work contributed to research on epidemiology, pathogenesis and immunprophylaxis of S. suis by identification and characterization of an invasive pathotype (mrp* epf- sly+ cps9), a new virulence factor (OFS) and a prognostic indicator (titer of opsonizing antibodies). Further investigations are necessary to better understand the function of OFS in the pathogenesis of S. suis. The objective to develop a cross protective vaccine was not yet achieved. However, development of animal models and evaluation of read out parameters can be considered an excellent basis to solve this problem in the near future.

 

keywords

Oberflächen-assoziierte Proteine, Streptococcus suis, Schwein, suface-associated proteins, swine

kb

193