Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Hakan Gürler

Effects of cryopreservation on mitochondrial function and DNA damage on bovine sperm

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103865

title (ger.)

Einfluss der Kryokonservierung auf die Mitochondrienfunktion und DNA-Integrität boviner Spermien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/guerlerh_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob DNA-Schäden nach Kryokonservierung das Ergebnis einer erhöhten Synthese von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sind, die insbesondere von geschädigten Mitochondrien gebildet werden.

Zur Gewinnung des Spermas standen je 4 Ejakulate von sechs Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh des Besamungsvereins Neustadt a. d. Aisch e.V. (BVN) zur Verfügung. Die prozentualen Anteile an plasmamembran- und akrosomintakten Spermien (PMAI; FITC-PNA/PI Assay), intakter Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential (HMMP-PMI; JC/PI Assay), das Ausmaß der ROS-Synthese plasmamembranintakter Spermien (DCFH, DCFH-DA/PI Assay; DHR, DHR/PI Assay; NO, DAF-2-DA/PI Assay; MITOSOX, MITOSOX/Sytox Green Assay) sowie der prozentuale Anteil der Spermien mit einem hohen Grad an DNA-Fragmentation (%DFI) wurden durchflusszytometrisch bestimmt. Der prozentuale Anteil progressiv motiler Spermien (PMS) wurde mithilfe eines computergestützten Spermienanalysesystems erfasst. Die Spermaproben wurden unmittelbar nach der Verdünnung bzw. nach dem Auftauen (0h) sowie nach 3h, 6h, 12h und 24h Inkubation bei 37°C vor (SBC = sperm before cryopreservation) und nach der Kryokonservierung (SAC = sperm after cryopreservation) untersucht.

Die PMS-, PMAI- und HMMP-PMI-Werte verringerten sich (P<0,05) während der Inkubationszeit sowohl bei SBC als auch bei SAC, wohingegen die NO-, DHR-, DCFH- und MITOSOX-Werte anstiegen. Die %DFI-Werte veränderten sich bei SBC im Laufe der 24-stündigen Inkubation nicht (P>0,05), während sie bei SAC anstiegen (P<0,0001). Zu allen Inkubationszeiten vor und nach der Kryokonservierung bestanden Korrelationen zwischen den PMS-, PMAI- und HMMP-PMI- Werten (P<0,0001). Vor der Kryokonservierung bestanden zu keinem Zeitpunkt signifikante Zusammenhänge zwischen %DFI einerseits und PMS, PMAI bzw. HMMP-PMI andererseits. Unmittelbar nach dem Auftauen (0h) bestanden zwischen den genannten Parametern moderate negative (-0,55<r<-0,62; P<0,05) und nach 3h Inkubation nur geringe negative Korrelationen (-0,39<r<-0,47; P<0,05). Ansonsten waren keine Zusammenhänge zwischen den Vitalitätsparametern PMS-, PMAI und HMMP-PMI einerseits und den %DFI-Werten andererseits festzustellen. Beziehungen zwischen der DNA-Fragmentation und den ROS-Parametern waren bei Spermien vor der Kryokonservierung nur nach 24h Inkubation zu beobachten. Zu diesem Zeitpunkt bestand eine geringgradig positive Korrelation zwischen NO und %DFI (r= 0,40; P<0,05). Nach der Kryokonservierung war nach 3h Inkubation eine mittelgradig positive Beziehung zwischen MITOSOX und %DFI (r=0,59; P<0,05) zu verzeichnen sowie nach 3h und 6h Inkubation geringgradig negative Zusammenhänge zwischen NO und %DFI (r= -0,48; P<0,05).

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Integrität der DNA boviner Spermien durch die Kryokonservierung negativ beeinflusst wird, so dass es im Gegensatz zu flüssigkonservierten Spermien bei kryokonservierten Spermien im Laufe einer 24-stündigen Inkubation bei 37°C zu einem Anstieg der DNA-Fragmentation kommt. Diese DNA Schädigung scheint jedoch nur in geringem Maße auf eine vermehrte Bildung von ROS an kryokonservierten Spermien zurückzuführen sein.

abstract (englisch)

The aim of this study was to investigate if DNA damage after cryopreservation is the result of an increased synthesis of reactive oxygen species (ROS) originating from damaged mitochondria.

Four ejaculates were collected from six Simmenthal bulls that were held at the Besamungsverein Neustadt Aisch in Germany. Sperm quality was evaluated by measuring the percentage of plasma membrane and acrosome intact sperm (PMAI: FITC-PNA/PI Assay), the percentage of plasma membrane intact sperm showing a high mitochondrial membrane potential (HMMP-PMI: JC1/PI Assay), the amount of ROS synthesis of plasma membrane intact sperm (DCFH, DCFH-DA/PI Assay; DHR, DHR/PI Assay; NO, DAF-2-DA/PI Assay; MITOSOX, MITOSOX/Sytox Green Assay) and the percentage of sperm with a high degree of DNA fragmentation (%DFI) by using flow cytometry. The percentage of progressively motile sperm (PMS) was determined by using a computer assisted sperm analysis system. Sperm samples were examined immediately after dilution/thawing (0h) as well as 3h, 6h, 12h, 24h incubation at 37°C both in sperm before (SBC= sperm before cryopreservation) and after cryopreservation (SAC= sperm after cryopreservation).

The values of PMS, PMAI, and HMMP-PMI decreased while the values of NO, DHR, DCFH, and MITOSOX increased during the incubation period both in SBC and SAC (P<0.05). The %DFI values did not change (P>0.05) during the 24-hour incubation time in SBC, whereas %DFI values increased in this time interval in SAC (P<0.0001). Significant correlations were found between PMS, PMAI and HMMP-PMI at all incubation times before and after cyropreservation (P<0.0001). Before cryopreservation there were no significant correlations between %DFI on the one hand and PMS, PMAI, and HMMP-PMI on the other hand. Between the last mentioned parameters there were moderate negative correlations immediately after thawing (0h) (‑0.55<r<-0.62; P<0.05) and weak negative correlations after 3h incubation (-0.39<r<-0.47; P<0.05). At all other time points no relationships (P>0.05) could be observed between %DFI and the vitality parameters PMS, PMAI, and HMMP-PMI. Before cryopreservation significant associations between DNA fragmentation and ROS parameters could be observed only after 24-hour incubation. At this time point there was a weak positive correlation (r= -0.40; P<0.05) between NO and %DFI. After cryopreservation a moderate positive correlation (r=0.59; P<0.05,) was noticed between MITOSOX and %DFI after 3h incubation and a moderate negative correlation (P<0.05, r=-0.48) between NO and %DFI after 3h incubation.

The results of this study show that DNA integrity of bovine sperm is impaired by cryopreservation. In contrast to extended sperm before cryopreservation a significant rise of DNA fragmentation could be observed in frozen-thawed sperm during an incubation period up to 24h at 37°C. However, this DNA damage seems to be caused only to a small extent by an increased ROS production of bovine frozen thawed sperm.

keywords

Durchflusszytometrie, Reaktive Sauerstoffspezies, bovine Spermien, DNA-Schäden, Flowcytometry, Reactive oxygen species, Bovine sperm, DNA damage

kb

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